Інформація призначена тільки для фахівців сфери охорони здоров'я, осіб,
які мають вищу або середню спеціальну медичну освіту.

Підтвердіть, що Ви є фахівцем у сфері охорони здоров'я.



СІМЕЙНІ ЛІКАРІ ТА ТЕРАПЕВТИ
день перший
день другий

АКУШЕРИ ГІНЕКОЛОГИ

КАРДІОЛОГИ, СІМЕЙНІ ЛІКАРІ, РЕВМАТОЛОГИ, НЕВРОЛОГИ, ЕНДОКРИНОЛОГИ

СТОМАТОЛОГИ

ІНФЕКЦІОНІСТИ, СІМЕЙНІ ЛІКАРІ, ПЕДІАТРИ, ГАСТРОЕНТЕРОЛОГИ, ГЕПАТОЛОГИ
день перший
день другий

ТРАВМАТОЛОГИ

ОНКОЛОГИ, (ОНКО-ГЕМАТОЛОГИ, ХІМІОТЕРАПЕВТИ, МАМОЛОГИ, ОНКО-ХІРУРГИ)

ЕНДОКРИНОЛОГИ, СІМЕЙНІ ЛІКАРІ, ПЕДІАТРИ, КАРДІОЛОГИ ТА ІНШІ СПЕЦІАЛІСТИ

ПЕДІАТРИ ТА СІМЕЙНІ ЛІКАРІ

АНЕСТЕЗІОЛОГИ, ХІРУРГИ

"Emergency medicine" 6(31) 2010

Back to issue

Апоптоз циркулирующих нейтрофилов при хирургическом сепсисе: патогенетическое значение и прогностические возможности

Authors: Нестеренко А.Н., Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького

Categories: Family medicine/Therapy, Medicine of emergency

print version


Summary

С целью изучения патогенетического значения апоптоза циркулирующих нейтрофилов при хирургическом сепсисе и возможности использования суправитального определения уровня апоптоза циркулирующих нейтрофилов как диагностического и прогностического критерия тяжести течения сепсиса проведено нерандомизированное ретроспективное когортное аналитическое обсервационное клиническое исследование 35 пациентов с хирургическим сепсисом. Посредством световой микроскопии окрашенных мазков из кондиционированной венозной крови определяли уровень апоптотических и некротически измененных нейтрофилов. Путем клинико-патоморфологических исследований уточнена роль задержки апоптоза нейтрофилов в патогенезе хирургического сепсиса, полиорганной дисфункции/несостоятельности, в танатогенезе сепсиса. Установлено, что задержка апоптоза нейтрофилов при хирургическом сепсисе способствует повреждению эндотелия и развитию митохондриально-микроциркуляторного дистресса, что приводит к трансформации сепсиса в тяжелый сепсис — сепсис с органной дисфункцией. Разработан способ прогнозирования тяжести течения сепсиса путем суправитального определения в венозной крови соотношения некротически измененных нейтрофилов к апоптотическим (Патент UA 15271).


Keywords

Патогенез и танатогенез хирургического сепсиса, апоптоз циркулирующих нейтрофилов, полиорганная дисфункция/несостоятельность, прогнозирование тяжести течения сепсиса.

В начале XXI столетия сепсис по-прежнему остается одной из самых актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту заболеваемости и стабильно высокой летальности. Сепсис входит в десятку ведущих причин смерти в цивилизованном мире. В структуре всех разновидностей сепсиса доминирует хирургический сепсис (ХС) [18–22].

С 2004 года во всем мире широко обсуждается новая парадигма, уточняющая приоритеты в патогенезе и интенсивной терапии (ИТ) сепсиса, базирующаяся на теориях микроциркуляторно-митохондриального дистресс-синдрома и DAMP — Dangerassociated molecular patterns [7, 20, 21]. Патофизиологические механизмы развития сепсиса в значительной степени являются результатом ответа врожденного иммунитета пациента под влиянием генетических факторов. Решающую роль в этом сложном каскаде событий играют нейтрофилы (Нф). Микробы и их токсины (pathogen-associated molecular patterns) распознаются нейтрофилами посредством толл-подобных рецепторов, подвергаются деструкции, поглощаются, перевариваются мигрирующими в очаг инфекции Нф и моноцитами. Происходит избыточная метаболическая активация Нф — респираторный взрыв с гиперпродукцией митохондриями Нф микробицидных активных форм кислорода (АФК) — синглетного кислорода 1O2, гипохлорита ClO–, перекиси водорода H2O2 и азота, которые повреждают не только микробы, но и митохондрии эндотелиоцитов. Активация других Нф, моноцитов, эндотелиоцитов провоцирует «цитокиновую бурю», активацию комплемента, вызывает митохондриальную дисфункцию, неуправляемый воспалительно-коагуляционный каскад с критическим нарушением микроциркуляции, повреждением тканей и развитием синдрома полиорганных нарушений (СПОН). Гиперпродукция Нф лизосомальных ферментов вызывает деструкцию не только микробов, но и клеток тканей хозяина, которые необратимо гибнут путем некроза. В условиях лавинообразно нарастающей интоксикации и митохондриального дистресса активируется апоптоз — заложенная природой в каждой клетке млекопитающих программа самоуничтожения, обратимый до определенного момента процесс, позволяющий биологически целесообразно контролировать количество и качество клеток различных тканей — нейтрофилов, лимфо-, эндотелио-, гепато-, энтеро-, миокардиоцитов и т.д., даже безъядерных эритроцитов [14]. Изучение процессов апоптоза при сепсисе позволит оптимизировать диагностическую и лечебную тактику [1–8, 10–14, 16, 17, 20–26].

Цель работы — изучить патогенетическое значение апоптоза циркулирующих нейтрофилов при хирургическом сепсисе и возможность использования суправитального определения уровня апоптоза циркулирующих нейтрофилов как диагностического и прогностического критерия тяжести течения ХС.

Материал и методы

Проведено нерандомизированное ретроспективное когортное аналитическое обсервационное клиническое исследование 35 пациентов (возраст — 18–76 лет, женщин — 17, мужчин — 18), находившихся на лечении в хирургических отделениях № 2 и 3 и реанимационном отделении Донецкого областного клинического территориального медицинского объединения с января 2003 по декабрь 2004 по поводу хирургического сепсиса вследствие перитонита (12), гнойников брюшной полости (6), забрюшинной флегмоны (4), гнилостного парапроктита (3), флегмоны мягких тканей (4), диабетической флегмоны/гангрены нижних конечностей (4), инфекции мочевых путей (2) с развитием органных дисфункций у всех, а септического шока — у 17 из 35 пациентов. Диагностика сепсиса — по рекомендациям

CCM/ESICM/ACCP/ATC/SIS ISDC [15]. Прогнозирование исхода проводили по шкале APACHE II, динамику органной дисфункции — по SOFA. После хирургической санации очага инфекции проводили антибактериальную, инфузионно-трансфузионную терапию, респираторную, инотропную, нутритивную, эфферентную, иммунотропную поддержку — комплекс ИТ до внедрения в практику принципов экстренной целенаправленной органопротективной терапии — модифицированного протокола MUST [2, 3, 22]. На этапах лечения проводили мониторинг витальных функций, исследование клинических, биохимических, иммунологических показателей, микробиологический контроль гемокультур, отделяемого дренажей. Вычисляли интегральные гематологические индексы, определяли относительное количество лимфоцитов (Лфц) в венозной крови, в т.ч. Лфц, экспрессирующих CD95 — рецепторы индукции апоптоза, CD25 — рецепторы к интерлейкину-2 (IL-2), уровень в крови метаболитов оксида азота (mNO), цитокинов — TNF-α и хемокина IL-8, хемилюминесценции лейкоцитов (ХЛ) — маркера респираторного взрыва лейкоцитов —концентрации АФК, уровень в крови продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) — диеновых конъюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА), состояние антиоксидантной системы (АОС) — по концентрации в крови альфа-токоферола, активности каталазы (Кат), супероксиддисмутазы (СОД) с вычислением коэффициента ПОЛ/АОС.

Определение коммитированных к апоптозу (Апо) и некротически измененных Нф производили путем световой микроскопии в тонких мазках венозной крови, окрашенных по Романовскому — Гимзе после предварительного кондиционирования венозной крови по методике, разработанной А.В. Седых [1, 4, 6]. На увеличении × 1000 просматривали тысячу клеток и учитывали (в ‰) измененные Нф, которые дифференцировали по характерным морфологическим признакам: апоптозные — по уменьшению размеров, по конденсированной цитоплазме, по уплотненному бесструктурному хроматину, часто разделенному на несколько округлых телец (рис. 1); некротические — по разрыву цитоплазматической и внутриклеточных мембран, по разрушению органелл, по выходу содержимого цитоплазмы в межклеточное пространство [1, 4, 6]. Исследование проводили в первые сутки после установления диагноза «сепсис», но не ранее 24 ч после хирургического устранения очага. Вычисляли отношение некротически измененных циркулирующих Нф к апоптозным.

Выполнены патоморфологические исследования внутренних органов 8 умерших пациентов.

Статистическая обработка проводилась при помощи программных пакетов MedStat (v. 4), Microsoft Excel, SPSS for Windows (v. 13). Применяли тест Шапиро — Уилка, t-критерий Стьюдента, W- и Т-критерии Вилкоксона, критерий χ2, множественные сравнения с использованием критериев Шефе, Даннета, Данна и рангового однофакторного анализа Крускала — Уоллиса, корреляционный анализ с использованием непараметрических коэффициентов — парной (Кендалла) и ранговой (Спирмена) корреляции. Группа здоровых — доноры-добровольцы. В сравниваемых группах оценивали шансы и риски летального исхода.

Результаты и обсуждение

Ретроспективно 35 пациентов были вначале разделены на 3 группы/когорты в зависимости от выраженности апоптоза нейтрофилов венозной крови (табл. 1, рис. 2).

Так, у 16 пациентов (группа А) этот показатель был в 2,8 раза (p < 0,01) снижен, у 9 (группа В) — в 1,2 раза (р < 0,05) снижен и у 10 (группа С) — в 1,5 раза (p < 0,05) повышен в сравнении со здоровыми (группа D). При вычислении соотношения некротически измененных Нф к апоптотическим выявлено, что в группе А этот показатель превышал показатель группы D (норма) в 4,1 раза (p < 0,01), группы В — в 3,9 раза (p < 0,05) и группы С — в 4,1 раза (p < 0,01). Недостоверными (p > 0,05) оказались различия по этому показателю в группах D, В и С (рис. 2B). При анализе течения ХС выяснено, что в группах В и С органная дисфункция не трансформировалась в развернутый СПОН, что позволило объединить пациентов этих групп в одну группу/когорту В + С (табл. 1).

Корреляционный анализ выявил достоверно высокую и среднюю степень связи между степенью тяжести состояния пациентов с такими показателями, как отношение некротически измененных к апоптотическим Нф, АпоНф, способность лейкоцитов к спонтанной миграции в очаг инфекции, антиоксидантная активность сыворотки и плазмы, а также с интегральными гематологическими индексами: индексом системной внутрисосудистой альтерации (ИСВА), индексом Нф/Лфц, ядерным индексом сдвига Нф, реактивным ответом Нф и гематологическим показателем интоксикации (табл. 2).

Уже в первые сутки после постановки диагноза ХС в группе А отмечено повышение уровней в венозной крови mNO, TNF-α, IL-8; ХЛ в сравнении как со здоровыми (p < 0,01), так и с группами В и С (рис. 2C–F), что свидетельствовало о более высоком уровне провоспалительных цитокинов, АФК и азота у пациентов с низким Апо Нф. ИСВА в группе А был достоверно выше как в сравнении со здоровыми, так и с группами В и С (рис. 3A), что указывало на более выраженную степень эндотелиальной дисфункции у пациентов с низким Апо Нф. Суррогатный маркер митохондриальной дисфункции ПОЛ/АОС был также выше у пациентов с низким Апо Нф (рис. 3B). Достоверно более выраженными были относительные лимфопения и нейтрофилез у пациентов с низким Апо Нф (рис. 3C–D). Повышение в сравнении со здоровыми концентрации циркулирующих Лфц-CD95 и понижение концентрации циркулирующих Лфц-CD25 отмечено во всех группах (А, В, С), но более выраженное — у пациентов с низким Апо Нф (рис. 3E–F), что свидетельствовало об иммунном дистрессе при ХС — повышении уровня апоптоза Лфц и снижении чувствительности Лфц к воздействиям цитокина IL-2, регулирующего ответ иммунной системы на антиген. По данным C. Oberholzer с соавт. (2001), апоптоз Лфц при сепсисе могут индуцировать как отсутствие в циркуляции IL-2, так и гиперпродукция TNF-α.

Проведен клинико-морфологический анализ танатогенеза 8 пациентов. В сосудах микроциркуляции у 6 умерших наблюдались набухание, десквамация и очаговая пролиферация эндотелиоцитов. У 5 — нарушения гемомикроциркуляции в виде стазов, сладжей эритроцитов, фибринных тромбов, лейкостазов. Наиболее часто эти изменения определялись в сосудах мозга, легких, реже — миокарда, печени, почек (рис. 4A–F).

Легкие, как единственный орган, получающий 100 % сердечного выброса (венозной крови, оттекающей из очагов инфекции), были первой мишенью в «каскаде» ПОН при ХС. Морфологическим эквивалентом клиники сепсис-индуцированного острого легочного повреждения были гистологические изменения в легких: полнокровие, отек, очаги эмфиземы и дисателектазов. В ряде случаев — мелкоочаговые кровоизлияния, сегментоядерная инфильтрация, пневмонические фокусы, утолщение и инфильтрация межальвеолярных перегородок нейтрофилами и макрофагами (рис. 4C).

Ведущим клиническим признаком у всех пациентов с ХС был инфекционно-воспалительный эндотоксикоз (ЭТ). Массивность токсической микробной нагрузки при абдоминальном ХС проявлялась развитием дисфункции печени и почек. Морфологическим эквивалентом эндотоксикоза, манифестирующего ПОН, были гистологические изменения органов детоксикации (рис. 4E–F).

Одним из самых ранних критериев диагностики ХС были нервно-психические нарушения. Морфологическим эквивалентом проявлений токсико-гипоксической, дисциркуляторной энцефалопатии при ХС были гистологические изменения головного мозга — периваскулярный и перицеллюлярный отек, венозное полнокровие, периваскулярные скопления лейкоцитов, выраженные дистрофические изменения нейронов, лейкостазы, набухание и десквамация эндотелия в сосудах микроциркуляторного русла мозга (рис. 4A–B). Отек головного мозга считали одним из наиболее танатогенетически значимых осложнений ХС.

Танатогенетическое значение при ХС имели нарушения трофики миокарда, что гистологически проявлялось у всех умерших полнокровием, выраженными дистрофическими изменениями миокардиоцитов (преимущественно вакуольная дистрофия) в миокарде, в половине случаев — с фрагментацией кардиомиоцитов, пролиферацией и десквамацией эндотелия капилляров в миокарде (рис. 4D).

Непосредственной причиной смерти одного пациента из группы В + С было массивное кровотечение из острых эрозий и стрессорных язв желудочно-кишечного тракта.

Таким образом, при изначально сопоставимой тяжести состояния и одинаковом уровне прогнозируемой летальности во всех исследуемых группах, но при стартовом достоверно более низком уровне апоптоза циркулирующих Нф (табл. 1) пациенты группы А продемонстрировали достоверно более высокие шансы и риски летального исхода в связи с развитием и прогрессированием органной дисфункции и СПОН, чем пациенты группы В + С (табл. 3). Можно предположить, что в патогенезе СПОН при ХС существенную роль сыграла пролонгация жизни циркулирующих полиморфноядерных нейтрофилов вследствие стартово достоверно более низкого уровня апоптоза циркулирующих Нф в группе А (рис. 2А). Не устраняемые путем апоптоза активированные Нф, покидая сосудистое русло и устремляясь в ткани органов (рис. 4В–С, E–F), продолжали гиперпродукцию мощных протеаз, NO, АФК (рис. 2С–F), которые не только повреждали микроорганизмы, но и вызывали универсальное повреждение эндотелиоцитов (рис. 4A, D), микроциркуляторно-митохондриальный дистресс, что приводило к развитию так называемой ранней цитокин-обусловленной органной дисфункции — недостаточности с трансформацией в танатогенетически значимую полиорганную несостоятельность.

Выводы

1. Полиморфноядерные нейтрофилы, как клетки первой линии неспецифической иммунной защиты организма от микробной агрессии, играют ключевую роль в патогенезе сепсиса и полиорганных нарушений.

2. Задержка апоптоза нейтрофилов при хирургическом сепсисе способствует повреждению эндотелия и развитию митохондриально-микроциркуляторного дистресса, что приводит к трансформации сепсиса в тяжелый сепсис — сепсис с органной дисфункцией.

3. Для прогнозирования тяжести течения хирургического сепсиса может быть использовано суправитальное определение уровня апоптотических и некротически измененных циркулирующих нейтрофилов с вычислением отношения некротически измененных нейтрофилов к апоптотическим, причем за значения нормы принимают значения отношения от 3,1 до 4,3 и при значениях этого отношения более 4,50, но менее 10, прогнозируют неосложненное течение хирургического сепсиса без развития полиорганной недостаточности, а при значениях этого отношения 10 и более прогнозируют осложненное течение хирургического сепсиса с развитием полиорганной недостаточности [4], что требует проведения экстренной целенаправленной органопротективной терапии — модифицированного протокола MUST.


Bibliography

1. Нестеренко А.Н. Апоптоз нейтрофилов как прогностический критерий течения хирургического сепсиса // Біль, знеболювання і інтенсивна терапія. — 2007. — № 3 (д). — С. 109-110.
2. Нестеренко А.Н. Ксилат в инфузионной терапии клинических синдромов тяжелого хирургического сепсиса // Укр. хіміотер. журнал. — 2008. — № 1–2 (22). — С. 254-258.
3. Нестеренко А.Н. Выбор антибактериальной терапии хирургического сепсиса с учетом региональных особенностей роста резистентности его основных возбудителей // Український журнал хірургії. — 2009. — № 2. — С. 101-109.
4. Пат. UA 15271, Україна, МПК6 G 01 N 33/48. Спосіб прогнозування перебігу хірургічного сепсису / Нестеренко О.М.; заявник і патентовласник Донецький держ. мед. університет ім. М. Горького. – № u 2006 00063; заявл. 03.01.06; опубл. 15.05.2006. Бюл. № 6.
5. Стариков Ю.В. Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе: Автореф. дисс. на соискание учен. степени канд. мед. наук: спец. 03.00.04 «Биохимия» и 14.00.16 «Патологическая физиология». — Новосибирск, 2008. — 22 с.
6. Черний В.И., Нестеренко А.Н. Нарушения иммунитета при критических состояниях: особенности диагностики // Внутренняя медицина. — 2007. — № 3. — С. 25-39.
7. Castellheim A., Brekke O.-L., Espevik. T. et al. Innate Immune Responses to Danger Signals in Systemic Inflammatory Response Syndrome and Sepsis // Scandinavian Journal of Immunology. — 2009. — Vol. 69. — P. 479-491.
8. Chakravarti A., Allaeys I., Poubelle P.E. Neutrophils and immunity: is it innate or acquired ? // Med. Sci (Paris). — 2007. — Vol. 23, № 10. — P. 862-867.
9. Dellinger R.P., Levy M.M., Carlet J.M. et al. Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock: 2008 // Intensive Care Med. — 2008. — Vol. 34, № 1. — P. 17-60.
10. Fialkow L., Filho L.F., Bozzetti M.C. et al. Neutrophil apoptosis: a marker of disease severity in sepsis and sepsisinduced acute respiratory distress syndrome // Crit. Care. — 2006. — № 6. — R155 (doi:10.1186/cc5090). Available online http://ccforum.com/content/10/6/R155.
11. Hotchkiss R.S., Osmon S.B., Chang K.C. et al. Accelerated Lymphocyte Death in Sepsis Occurs by both the Death Receptor and Mitochondrial Pathways // J. Immunol. — 2005. — Vol. 174. — P. 5110-5118.
12. Huet O., Obata R., Aubron C. et al. Plasmainduced endothelial oxidative stress is related to the severity of septic shock // Crit. Care Med. — 2007. — vol. 35. — P. 821-826.
13. Kantari C., Pederzoli-Ribeil M., Witko-Sarsat V. The role of neutrophils and monocytes in innate immunity // Contrib. Microbiol. — 2008. — Vol. 15. — P. 118-146.
14. Kempe D.S., Akel A., Lang P.A. et al. Suicidal erythrocyte death in sepsis // J. Mol. Med. — 2007. — Vol. 85, № 3. — P. 269-277.
15. Levy M.M., Marshall J.C., Fink M.P. et al. 2001 SCCM/ ESICM/ ACCP/ ATC/ SIS International Sepsis Definitions Conference // Crit. Care Med. — 2003. – Vol. 31, № 4. — P. 1250-1256.
16. Maianski N.A., Maianski A.N., Kuijpers T.W., Roos D. Apoptosis of Neutrophils // Acta Haematol. — 2004. — Vol. 111. — P. 56-66.
17. Maianski N.A., Geissler J., Srinivasula S.M. et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis // Cell. Death and Differentiation. — 2004. — Vol. 11. — P. 143-153.
18. Martins P.S., Kallas E.G., Neto M.C. et al. Upregulation Of Reactive Oxygen Species Generation And Phagocytosis, And Increased Apoptosis In Human Neutrophils During Severe Sepsis And Septic Shock // SHOCK. — 2003. — Vol. 20, № 3. — P. 208-212.
19. Moerer O., Quintel M. Definition, Epidemiologie und konomische Aspekte der Sepsis bei Erwachsenen (Sepsis in adult patients – definitions, epidemiology and economic aspects) // Der Internist. — 2009. — DOI 10.1007/s00108 — 008 — 2285 — 7.
20. Picard K.M., O’Donoghue S.C., Young-Kershaw D.A., Russell K.J. Development and Implementation of a Multidisciplinary Sepsis Protocol // Critical Care Nurse. — 2006. — Vol. 26, № 3. — P. 43-54.
21. Remick D.G. Pathophysiology of Sepsis // Am. J. Pathology. — 2007. — Vol. 170, № 5. — P. 435-1444.
22. Shapiro N.I., Howell M., Talmor D. et al. Implementation and Outcomes of the Mutliple Urgent Sepsis Therapies (MUST) Protocol // Crit. Care Med. — 2006. — Vol. 34, № 4. — P. 1025-1032.
23. Shimaoka M., Park E.J. Advances in understanding sepsis // Eur. J. Аnaesthesiol. Suppl. — 2008. — Vol. 42. — P. 146-153.
24. Unsinger J., McDonough J.S., Shultz L.D. et al. Sepsisinduced human lymphocyte apoptosis and cytokine production in «humanized» mice // J. Leukoc. Biol. — 2009. — Vol. 86. — Uncorrected Version. Published on April 15, 2009 as DOI:10.1189/ jlb. 1008615. www.jleukbio.org.
25. Wesche-Soldato D.E., Lomas-Neira J.L., Perl M. et al. The role and regulation of apoptosis in sepsis // Journal of Endotoxin Research. — 2005. — Vol. 11, № 6. — Р. 375-382.
26. Wesche D.E., Lomas-Neira J.L., Perl M. et al. Leukocyte apoptosis and its significance in sepsis and shock // Journal of Leukocyte Biology. — 2005. — Vol. 78. — P. 325-337.


Back to issue