Журнал "Гастроэнтерология" 1 (47) 2013

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) — одно из ведущих хронических заболеваний печени в развитых странах. Популяционные исследования показали, что, по данным сонографического исследования печени и аутопсий, проведенных на протяжении 20 лет, распространенность НАЖБП составляет около 20 % среди населения в западных странах и 15 % в восточных регионах. Наблюдение за этими пациентами подтвердило у них более высокие показатели летальности, чем в общей популяции. Более того, существенное количество пациентов с НАЖБП имеют тяжелый фиброз печени, который через какое-то время прогрессирует. Прогрессирование НАЖБП тесно связывают с сахарным диабетом (СД-2), ожирением и метаболическим синдромом [1]. Исследования в группах пациентов с НАЖБП продемонстрировали связь уровня адипоцитокинов сыворотки крови с развитием заболевания. Адипоцитокины — группа биоактивных протеинов, выделенных из жировой ткани, влияющих на развитие инсулинорезистентности (ИР). Адипонектин представляет собой адипокин, который регулирует метаболизм глюкозы, липидов и процессы воспаления. Исследования на животных показали способность адипонектина ингибировать воспалительные пути и приводить к торможению развития атеросклероза. Низкая плазменная концентрация адипонектина связана у здоровых добровольцев с ИР и является предиктором увеличения риска развития ИР и СД-2 [1].

Связь между адипоцитокинами и НАЖБП может быть первичной или вторичной. С одной стороны, больные со специфическим генетическим паттерном могут иметь особый адипокиновый профиль, предрасполагающий к развитию НАЖБП. С другой стороны, собственно адипокиновый статус может быть причиной манифестации ИР в отсутствие других причин [2].

В последние годы появляются данные относительно влияния адипонектина и его рецепторов на регуляцию метаболизма жиров и углеводов, однако результаты исследований не всегда однозначны. Не так давно были клонированы гены рецепторов адипонектина-1 (ADIPOR1) и -2 (ADIPOR2). Оба рецептора опосредуют эффекты глобулярной части и/или всей молекулы адипонектина. У мышей экспрессия mRNA ADIPOR1 в основном обнаружена в скелетной мускулатуре, а самые высокие концентрации mRNA ADIPOR2 были найдены в печени. В противовес этому в тканях человека самые высокие уровни mRNA обоих рецепторов были найдены в скелетной мускулатуре [3]. Они положительно коррелируют с инсулиночувствительностью, что подтверждено в недавнем исследовании [2]. Это дает основание думать о том, что рецепторы адипонектина, возможно, также модулируют ИР в человеческом организме. Однако инсулин показал способность воздействовать на экспрессию рецепторов адипонектина в органах-мишенях, таких как скелетная мускулатура и печень. In vivo при возрастающем дефиците инсулина его пополнение угнетает экспрессию ADIPOR1 и ADIPOR2, вовлекая в процесс инсулин/фосфоинозитид-3-киназный/Foxo-1-путь. Поэтому остается дискутабельным вопрос относительно ассоциации уровня экспрессии адипонектиновых рецепторов и чувствительности к инсулину.

Единым подходом к определению роли рецепторов адипонектина является изучение полиморфизма генов рецепторов адипонектина, а также связи его с различными метаболическими нарушениями, особенно с инсулинорезистентностью. С учетом того, что липидные включения, находящиеся в мышцах и печени, являются важными детерминантами ИР, а адипонектин увеличивает окисление липидов в этих тканях, нами проведено исследование, целью которого являлось изучение влияния полиморфизма гена ADIPOR1 на формирование НАЖБП. Основные задачи исследования: выявить фенотипические особенности пациентов с НАЖБП в зависимости от полиморфизма ADIPOR1, определить наличие взаимосвязи между полиморфизмом ADIPOR1 и жира в печени, а также установить связь полиморфного гена с основными метаболическими показателями.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования были 112 человек с НАЖБП, средний возраст которых составил (42,8 ± ± 4,2) года, из них 64 мужчины и 48 женщин. У 92 (82,1 %) пациентов имела место избыточная масса тела, у 62 (55,4 %)  диагностировали нарушения углеводного обмена в виде нарушения толерантности к углеводам или сахарного диабета 2-го типа. Клинические признаки артериальной гипертензии были выявлены у 59 (52,7 %) пациентов с НАЖБП, дислипидемии — у 56 (50 %), ишемической болезни сердца — у 42 (37,5 %). У преимущественного большинства обследованных пациентов верифицировано наличие метаболического синдрома согласно критериям IDF (2005). Контрольную группу составили 30 здоровых лиц.

Всем пациентам, включенным в исследование, на основании проведенной компьютерной томографии установлен стеатоз печени по критериям, предложенным В. Birnbaum et. al. (2007), Y. Kodama et al. (2007).

Для определения степени стеатоза печени проводилось вычисление индекса H/R посредством анализа изображений, полученных при исследовании гепатобилиарной системы на ультразвуковом сканере Philips-IU (США), конвексным мультичастотным датчиком 2–5 МГц.

Все пациенты употребляли менее 20 г/день этанола, не имели признаков хронического вирусного гепатита В, С, D; аутоиммунного и лекарственного гепатита, болезни Коновалова — Вильсона, идиопатического гемохроматоза, врожденной недостаточности a1-антитрипсина.

Для оценки функционального состояния печени проводились исследования белкового, пигментного, ферментативного обменов по стандартным общепринятым методикам. У всех пациентов ферментативным методом на автоанализаторе Humalyzer (фирма Human, Германия) определяли уровень общего холестерина (ОХС), холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС ЛПВП) и триглицеридов (ТГ). Содержание холестерина в составе липопротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП) вычисляли по формуле W.T. Friedewald с учетом измерения показателя в ммоль/л: ХС ЛПНП = ОХС – (ХС ЛПВП + ТГ / 2,22).

Для оценки углеводного обмена исследовали уровень глюкозы натощак глюкозооксидазным методом, на анализаторе Humаlizer. Определение гликозилированного гемоглобина (HbA_1с) осуществлялось при помощи набора «Реагент» (Украина) по реакции с тиобарбитуровой кислотой и общего гемоглобина на спектрофотометре Specol-11 (Германия). Концентрацию инсулина натощак в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом, при помощи набора реактивов DRG (США). Индекс инсулинорезистентности рассчитывали по формуле: HOMA-IR = инсулин ґ глюкоза / 22,5.

Иммуноферментным методом проведено определение уровня адипонектина в сыворотке крови.

Антропометрические данные использовали для расчета процента жировой массы тела (% ЖМТ) в организме. Вычисление % ЖМТ осуществлялось с использованием 4-компонентной модели, которая имеет следующий вид:

% ЖМТ = 64,5 – 848 / индекс массы тела + 0,079 ґ ґ возраст – 16,4 ґ пол + 0,05 ґ пол х возраст + 39,0 ґ ґ возраст / индекс массы тела,

где пол имеет значение «0» для женщин и «1» — для мужчин. Среднеквадратичная ошибка оценки ЖМТ составляет 5 % жировой массы, а коэффициент множественной регрессии R — 0,86.

Молекулярно-генетическое тестирование ДНК выполняли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови по стандартному протоколу с использованием набора реагентов Diatom™ DNA Prep 200 (производство ООО «Лаборатория ИзоГен»). Данный метод является одним из наиболее эффективных для выделения ДНК с минимальной продолжительностью экстрагирования, он не уступает, а в ряде случаев и превосходит зарубежные аналоги, по своим характеристикам предназначенный для выделения ДНК из различных биологических материалов (жидкостей, измельченных твердых материалов, пятен крови и т.д.), а также для быстрой очистки ДНК из клинических проб (цельной крови, плазмы, сыворотки, мочи, соскобов слизистой и т.д.). Выход чистой ДНК из цельной крови составляет 5–10 мкг из 200 мкл крови.

Принцип действия набора Diatom™ DNA Prep основан на использовании лизирующего агента с гуанидинтиоцианатом, который предназначен для разрушения клеток, солюбилизации клеточного дебриса, а также денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии лизирующего реагента ДНК активно сорбируется на сорбенте NucleoS™, затем легко отмывается от солей и белков спиртовым раствором. ДНК, элюированная из сорбента Экстра-Геном™ или чистой водой, может исследоваться различными методами.

Методической основой генотипирования являлась тетрапраймерная полимеразная цепная реакция с использованием двух внутренних аллельспецифичных праймеров:

AD16666089S337 5’ — ATGAAATAGTATTATTTTATTCCC-3’,

AD16666089S167 5’ — ATAATTACCTCATCTGAAAAGTA-3’;

и двух внешних праймеров:

AD16666089F 5’ — ACCTCAATATGGCTGTTAACTCC-3’,

AD16666089R 5’ — CTGAGGGTTTTATACAAATGG-3’.

Метод позволяет амплифицировать фрагменты ДНК различной длины, соответствующие альтернативным аллелям. Каждый внешний праймер в сочетании с соответствующим ему внутренним праймером инициирует амплификацию аллельспецифичных фрагментов (337 п.н. — норма и 167 п.н. — мутация).

Дизайн олигонуклеотидных праймеров для проведения полимеразной цепной реакции осуществлялся посредством программы Vector NTI (Invitrogen) и информационного ресурса NCBI.

В данной работе ПЦР последовательности гена ADIPOR1 rs6666089 проводилась в автоматическом режиме на термоциклерах «Терцик» («ДНК-технология»), GeneAmp^® 9700 с 96-ячеечным блоком (Applied Biosystems) с использованием коммер­ческого набора реактивов GenePak@PCR Core «Изоген» в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя.

Температурно-временной режим полимеразной цепной реакции оптимизирован для амплификации данной нуклеотидной последовательности: инициирующая денатурация — 95 °С — 2 мин — 1 цикл; денатурация — 95 °С — 30 с; отжиг праймеров — 56 °С — 15 с; 40 циклов; элонгация — 74 °С — 30 с; завершающая элонгация — 74 °С — 2 мин — 1 цикл.

Детекция ПЦР-продуктов проводилась с помощью горизонтального электрофореза в пластине 2,5% агарозного геля с добавлением бромистого этидия — специфического интеркалирующего флуоресцентного ДНК(РНК)-красителя — с использованием стандартного трис-боратного буфера при напряженности поля ~ 20 В/см в течение 30 минут. Поглощая ультрафиолетовый свет с максимальной длиной волны 256 нм, бромид этидия, связанный с участком ДНК (ампликоном), способен в соответствии с правилом Стокса флуоресцировать, что регистрируется в видимом спектре (610–620 нм) в виде оранжевой полоски. Получаемые результаты электрофореза ампликонов оценивали в проходящем ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе TFP-M/WL (Vilber Lourmat). Фиксирование результатов проводилось посредством стандартной гель-документирующей системы с использованием программного обеспечения Vitran Photo.

Статистическая обработка данных выполнялась с помощью пакета статистических программ Statistiсa 6.0, SPSS 13.0. Вычисление средней величины М, средней погрешности средней величины m, критерия достоверности t, значения достоверности р для независимых выборок — при сравнении выходных данных, при анализе динамики исследуемых показателей — с использованием t-критерия для связанных выборок. Для проведения регрессионного анализа использовалась программа SPSS (version 13.0 for Windows; SPSS, Chicago, IL). Расхождения между сравниваемыми показателями были достоверны, если значения были не менее 95 % (р < 0,05).

Результаты

У обследованных пациентов с НАЖБП в сравнении с контрольной группой, репрезентативной по полу и возрасту, отмечались достоверные нарушения липидного (повышение ОХС, ТГ, липопротеидов очень низкой плотности — ЛПОНП), углеводного обменов (повышение глюкозы натощак, уровня HbA_1c), изменения состояния инсулинорезистентности (существенное повышение инсулинемии натощак, HOMA-IR-индекса) и хроническое воспаление низкой интенсивности (повышение С-реактивного протеина и фактора некроза опухолей а), р < 0,05. Уровень адипонектина — гормона адипоцитов, которому присущи метаболический, инсулиномиметический и антиатерогенный эффекты, был существенно снижен в сравнении с контролем: (7,43 ± ± 0,41) нг/мл против (10,20 ± 2,60) нг/мл, р < 0,05.

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного гена rs666089 ADIPOR1 показал наличие ассоциации аллелей G (х² = 134,36, р = 0,0000) и A (х² = 29,32, р = 0,0000), а также генотипов GG, GА, АА (х² = 141,75, р = = 0,0000) с развитием НАЖБП (табл. 1).

Полученные данные позволили проанализировать основные изменения антропометрических и метаболических показателей в зависимости от генотипов полиморфного гена rs6666089 ADIPOR1 (табл. 2).

Оказалось, что носители разных генотипов G/G, G/А, А/А гена rs6666089 ADIPOR1 имеют существенные отличия по показателям антропометрии, углеводного обмена и функциональных проб печени, которые, вероятно, вносят свой вклад в развитие и прогрессирование НАЖБП.

Обращало на себя внимание достоверное повышение у гетерозигот GA и гомозигот АA % ЖМТ (p < 0,028), уровня мембранно-связывающего фермента гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП) — маркера кардиоваскулярного риска (p < 0,046), а также HbA_1c (p < 0,034) в сравнении с контрольными значениями.

Учитывая, что у 80 % пациентов с НАЖБП была найдена положительная корреляционная связь между % ЖМТ и % жира в печени (r = +0,52, p < 0,0002), нами проанализировано процентное содержание жира в печени в зависимости от генотипов rs6666089 ADIPOR1.

Представленные на рис. 1 данные свидетельствуют о наличии большего количества жира в печени у носителей аллели G полиморфного маркера rs6666089 ADIPOR1.

Обсуждение

Хотелось бы подчеркнуть, что у пациентов, которые являются носителями аллели G в однонуклеотидном полиморфизме rs6666089 ADIPOR1 в промоторе гена, развитие НАЖБП ассоциировано с инсулинорезистентностью, повышением содержания жира в печени. Эти факты согласуются с гипотезой о том, что механизм действия адипонектина, вероятно, включает его прямое влияние на обмен липидов в печени, в результате которого снижается количество жира в печени.

При этом в опубликованных работах представлены разноречивые результаты. Так, Staiger с коллегами утверждают, что экспрессия ADIPOR1 коррелирует с уровнем инсулина [3]. Результаты, полученные Damcott, выявили наличие связи ADIPOR1 с нарушением толерантности к углеводам и СД-2 [4], в то время как результаты работы Wang показали отсутствие этой взаимосвязи [5]. По данным другого исследования [6], ни один из SNP в ADIPOR1 не связан с развитием ИР и СД-2.

Результаты нашего исследования согласуются с данными N. Stefan, которым дополнительно проведено изучение гаплотипа, показавшего, что последний с аллелью8503 A ассоциирован с формированием инсулинорезистентности. Однако для окончательного определения роли этого SNP в регуляции формирования НАЖБП необходимо проведение дополнительных исследований в других популяциях.

Получены противоречивые данные о наличии взаимосвязи антропометрических данных с риском формирования НАЖБП. Damcott с коллегами не удалось выявить связь между SNPs и параметрами тела [4], в то время как Berner отмечает связь SNP ADIPOR1 с индексом массы тела (ИМТ) и отношением окружность талии/окружность бедер в исследовании DPS [6]. В популяции DPS различные генотипы гена ADIPOR1 ассоциировались с индикаторами центрального ожирения, что связано с ИР, метаболическим синдромом, без связи с ИМТ [7].

Нами установлено, что SNP rs6666089 в промоторе гена ADIPOR1 ассоциирован не только с развитием ИР, но и с повышенным содержанием жира в печени. Известно, что эктопическое отложение жира, в частности в печени, считается главным фактором, обусловливающим развитие НАЖБП в условиях инсулинорезистентности [8, 9]. Наличие большего количества жира в печени больных – носителей аллели G подтверждает гипотезу, согласно которой регуляция накопления жира в печени может отражать связь между полиморфизмом и инсулинорезистентностью [10]. Вероятно, больные с НАЖБП, носители GG-, GA-генотипов rs6666089 ADIPOR1, нуждаются в более интенсивной терапии для уменьшения стеатоза печени и улучшения чувствительности к инсулину.

Полученная связь аллели G с более высокими уровнями HbA_1c и ГГТП, вероятно, может быть обусловлена тем, что в изучаемой группе пациентов с НАЖБП распределение генотипов могло отличаться у пациентов с нормальной и нарушенной толерантностью к глюкозе, а также с кардиоваскулярными рисками и без них.

В целом можно констатировать, что выделены вариации гена rs6666089 ADIPOR1, которые ассоциированы с формированием ИР и большим содержанием жира в печени у пациентов НАЖБП, что подтверждает гипотезу о том, что адипонектин в организме человека может регулировать количество жира в печени и чувствительность к инсулину.

Выводы

Предрасположенность к развитию НАЖБП у пациентов, имеющих метаболические нарушения, обусловлена достоверной ассоциацией аллелей и генотипов полиморфного маркера гена rs6666089 ADIPOR1. Формирование НАЖБП связано с носительством G-аллели полиморфного гена rs6666089 ADIPOR1. Полученные данные подтверждают генетическую детерминированность НАЖБП и связанных с ней ожирения, СД-2, дислипидемии, что позволяет на доклиническом этапе выявлять группы риска, проводить профилактику возникновения клинических проявлений НАЖБП, при необходимости уточнять диагноз с помощью определения полиморфных маркеров генов-кандидатов, ассоциированных с развитием НАЖБП и метаболическими нарушениями. Выявленные метаболические изменения в зависимости от генотипов rs6666089 ADIPOR1 позволят индивидуализировать метаболический статус этих пациентов и выработать алгоритм своевременной адекватной терапии. Такая комплексная оценка необходима не только для предотвращения развития заболевания, но и для снижения частоты возникновения осложнений в виде прогрессирования в цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному, а также улучшения качества жизни этого контингента больных.

Перспективы дальнейших исследований в этом направлении должны базироваться на изучении роли генов-кандидатов развития НАЖБП на большем объеме выборки, их связи с различными метаболическими параметрами, что позволит уточнить роль генов, в т.ч. ADIPOR1, в формировании НАЖБП.