Журнал «Внутренняя медицина» 3(3) 2007

Продолжение. Начало в №2, 2007

Цитокины

Цитокины — продуцируемые активированными клетками низкомолекулярные белково-пептидные факторы, которые осуществляют короткодистантную регуляцию межклеточных взаимодействий всех звеньев иммунной системы, а также межсистемные взаимодействия. Цитокины определяют выживаемость, стимуляцию или угнетение роста клеток, их дифференцировку, функциональную активацию и апоптоз [29, 35].

После взаимодействия цитокинов с соответствующими рецепторами на поверхности клеток сигнал через элементы внутриклеточного преобразования передается в ядро клетки, где активируются соответствующие гены, ответственные за выработку клеткой низкомолекулярных белковых веществ — регуляторов упомянутых выше процессов.

Цитокины — это гормоноподобные молекулы. Действие их происходит через высокоаффинные, высокоспецифические рецепторы на мембране клетки-мишени. В отличие от классических гормонов большинство цитокинов — молекулы паракринного, локального действия. Они вырабатываются и используются клетками, которые находятся в тесной близости. Вместе с тем возможно действие и на ту же клетку, которая секретировала данный цитокин (аутокринное действие).

Секреция цитокинов — краткосрочный процесс. Время полураспада большинства цитокинов в кровотоке измеряется минутами.

В настоящее время наиболее хорошо изученными и наиболее часто используемыми в диагностических целях являются цитокины иммунной системы и факторы роста.

В зависимости от того, какие клетки иммунной системы преимущественно синтезируют тот или иной цитокин, различают интерлейкины, монокины и лимфокины. Цитокины можно разделить на несколько «семейств»: интерлейкины (в настоящее время известно 23 интерлейкина: IL-1 — IL-23), интерфероны, опухоленекротизирующие факторы, трансформирующие факторы роста, хемокины и др. (табл. 1).

Таблица 1. Клетки-продуценты и главные функции клинически важных цитокинов человека

Условно выделяют четыре группы цитокинов иммунной системы [7, 29, 35]:

— гемопоэтические факторы (колониестимулирующие факторы, IL-3, IL-7, эритропоэтин) — стимуляторы роста и созревания незрелых кроветворных клеток;

— регуляторы естественного (врожденного, неинфекционного) иммунитета (IFN-β и -α, IL-1 и IL-6, TNF-α, хемокины IL-8, MCP-1, RANTES и др.). Они участвуют в неспецифической защите организма от бактериальных и вирусных инфекций. Их основные мишени — клетки-макрофаги и гранулоциты;

— цитокины, регулирующие специфические иммунные реакции (IL-2, IL-4, трансформирующий фактор роста — TGF-β и др.). Они участвуют в активации, росте и дифференцировке зрелых лимфоцитов;

— цитокины, регулирующие воспалительные реакции, развивающиеся в процессе специфического иммунного ответа (IFN-γ, лимфотоксин, IL-5, IL-10 и др.). Они активируют неспецифические эффекторные клетки — цитотоксические макрофаги и естественные киллеры.

При критических состояниях антигенная стимуляция приводит к секреции цитокинов «первого поколения» — IL-1 и IL-6, TNF-α, которые индуцируют синтез центрального регуляторного цитокина IL-2, а также IL-3, -4, -5, IFN-γ и др. — цитокинов «второго поколения». Они, в свою очередь, влияют на синтез ранних цитокинов. Этот принцип позволяет не только регулировать иммунный ответ, но распространять и усиливать его, вовлекая все большее число клеток.

Так, IL-2 появляется в цитоплазме Т-клеток уже через 2 ч после стимуляции; IL-4 — через 4 ч, IL-10 — через 6 ч, IL-9 — через 24 ч. Пик выработки различных лимфокинов варьирует от 12 ч для IL-2, 48 ч для IL-4 и IL-5 до 72 ч для IL-9 и IFN-γ.

Эффекты цитокинов иммунной системы тесно связаны с физиологическими и патофизиологическими реакциями организма. При этом происходит модуляция как локальных, так и системных механизмов защиты. Одна из важнейших функций системы цитокинов — обеспечение согласованного действия иммунной, эндокринной и нервной систем в ответ на стресс [10, 29].

Клиническая ценность определения некоторых цитокинов в диагностике синдромов критических состояний

Интерлейкин-1 (IL-1 α, IL-1 β) играет одну из центральных ролей в воспалительной реакции, в ответе на бактериальную инфекцию, повреждение тканей, вызванное ультрафиолетовым облучением. Стимулирует секрецию гепатоцитами сывороточных амилоидов А и Р, С-реактивного белка, гаптоглобина, α₁-антитрипсина, церулоплазмина. IL-1 участвует в регуляции температуры тела, его повышенная продукция приводит к развитию лихорадки. Глюкокортикостероиды и простагландины снижают активность IL-1. Сильное повышение уровня IL-1 приводит к артериальной гипотонии, анорексии.

Повышение уровня IL-1 наблюдается при септическом шоке, воспалительном поражении кишечника, сахарном диабете I типа.

Интерлейкин-2 (IL-2) играет исключительно важную роль в реализации механизмов иммунного ответа.

Интерлейкин-4 (IL-4) — лимфокин, оказывающий наиболее сильный эффект на регуляцию образования других цитокинов посредством участия в многочисленных биологических процессах, таких как иммунный ответ и воспалительные реакции.

Интерлейкин-6 (IL-6) индуцирует синтез белков острой фазы, в связи с чем (наряду с IL-1 и TNF-α) его относят к провоспалительным цитокинам. Есть данные о повышении IL-6 и TNF-α в плазме крови при различных атопических реакциях (аллергия, астма).

Интерлейкин-8 (IL-8) известен как фактор активации нейтрофилов. Этот хемокин активирует нейтрофилы, в меньшей степени другие гранулоцитарные лейкоциты, вызывая их хемотаксис в очаг воспаления. IL-8 активирует также и моноциты. Повышенный уровень IL-8 ассоциируется с хроническими и острыми воспалительными состояниями, коррелирует с тканевой инфильтрацией нейтрофилами при язвенном колите.

Фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) повышает проницаемость капилляров, повреждает эндотелий сосудов, вызывает гиперкоагуляцию, активирует систему комплемента с последующей аккумуляцией нейтрофилов и внутрисосудистым тромбообразованием. Повышение уровня TNF-α у больных с сепсисом носит фазный характер. Снижение сывороточного уровня TNF-α при упорной инфекции отражает несостоятельность системы защиты организма (В.С. Тимохов с соавт., 1997).

В научной литературе встречается условное деление цитокинов на провоспалительные (IL-1, -3, -6, -8, -12; TNF-α; IFN-γ; CSF) и противовоспалительные (IL-4, -10, -13; TGF-β).

По мнению R.C. Baker и соавт. (2002), провоспалительные цитокины в норме редко определяются в плазме. Их появление и нарастание титров в плазме отмечается при развитии воспалительной реакции. Противовоспалительные цитокины (в противоположность провоспалительным) постоянно присутствуют в плазме в измеряемых концентрациях.

Теоретически R.C. Baker с соавт. (2002) объясняют этот феномен различной молекулярной массой цитокинов упомянутых двух групп. Так, провоспалительные цитокины обладают довольно низким молекулярным весом (TNF α= 17 кД; IL-1 = 17 кД; IL-3 = 15–28 кД; IL-6 = 21–28 кД; IL-8 = 8–10 кД), что позволяет почкам их фильтровать и выводить из организма. Противовоспалительные цитокины обладают довольно высокой молекулярной массой, что способствует их сохранению в плазме.

В настоящее время нет единого мнения относительно уровня у здоровых доноров ключевого медиатора воспаления — TNF-α. Так, по данным группы компаний «БиоХимМак» (2002), концентрация циркулирующего TNF-α у здоровых очень низка (< 5 пг/мл), с резким возрастанием (максимум в течение 90 мин) после введения LPS, превышает значения 300 пг/мл во время септического шока [10]. Норма сывороточной концентрации TNF-α у здоровых для тест-систем ООО «Цитокин» составляет от 0 до 50 пкг/мл [35]. О.В. Куценко с соавт. (AML. — VII (3). — 2001) нормой TNF-α считают < 2 пг/мл. Другие авторы приводят значения сывороточного TNF-α у здоровых от 8,98 ± 0,68 пг/мл (И.П. Шлапак с соавт., 2002); 16 ± 3 пг/мл (Т.Е. Белокриницкая, Ю.А. Витковский, 1999); 34,3 ± 6,3 пг/мл (Т.И. Гавриленко с соавт., 2002); 40,5 ± 6,3 пг/мл (В.Н. Коваленко с соавт., 2001) до 75,3 ± 15,6 пг/мл (В.С. Тимохов с соавт., 1997).

Содержание в сыворотке крови фактора некроза опухоли альфа — tumor necrosis factor alfa (TNF-α)

Показатели у здоровых лиц, принятые в качестве региональной нормы (по данным авторов): 76,90 ± 3,360 пг/мл. Референтные величины: 55,79–90,07 пг/мл.

Диагностическое значение. Определение уровня TNF-α нельзя отнести к широко доступным, повседневным, обычным, так называемым рутинным лабораторным исследованиям. Однако ключевая роль фактора некроза опухоли альфа — TNF-α (кахектина) в развитии критических состояний (наряду с некоторыми другими цитокинами — медиаторами воспаления) требует осветить ряд принципиальных моментов.

Главный источник TNF-α — активированные моноциты-макрофаги. TNF-α обладает ярко выраженной способностью вызывать геморрагический некроз опухоли, скорее всего, опосредованно через эндотелий сосудов, питающих опухоль. В высокой концентрации он способен повреждать клетки эндотелия и увеличивать микроваскулярную проницаемость. Это вызывает активирование системы гемостаза и комплемента, за которым следует аккумуляция нейтрофилов и микрососудистое тромбирование.

Увеличение в сравнении с контролем уровня TNF-α свыше 600 пкг/мл свидетельствует о наличии цитокиновой гиперактивации, а в сочетании с моноцитозом, тромбоцитопенией, лимфопенией, снижением количества CD25 (ИЛ-2 Р-позитивных клеток) является лабораторным признаком синдрома системного воспалительного ответа — SIRS.

Прогностическое значение уровня TNF-α определяется следующим образом:

— понижение уровня TNF-α в сравнении с контролем или отсутствие отличия его от контрольных показателей в сочетании с моноцитозом, лимфопенией, нейтрофилезом, увеличением ЯИ свидетельствует о наличии метаболического иммунодефекта;

— низкий (ниже 30 пкг/мл) в сравнении с контролем уровень TNF-α при критическом состоянии, отсутствие его динамики под влиянием лечения наряду с сохранением моноцитопении, лимфопении, увеличением ЯИ свидетельствует о наличии иммунопаралича и является плохим прогностическим признаком;

— повышенный (свыше 700 пкг/мл) в сравнении с контролем уровень TNF-α при критическом состоянии, а также его увеличение в динамике более 1000 пкг/мл в сочетании с сохранением моноцитоза, нейтрофилеза, лимфопении, тромбоцитопении, увеличением ЯИ, уровня СМ, а также под влиянием агрессивной антибактериальной терапии свидетельствует о срыве регуляторных механизмов продукции TNF-α и является отражением «неуправляемого цитокинового каскада», признаком иммунотоксикоза [1, 18, 37, 38, 40].

Способы объективизации эндотелиальной дисфункции при критических состояниях

Сложившийся традиционный взгляд на клеточный иммунитет как на процесс взаимодействия ограниченного числа иммунокомпетентных клеток, преимущественно лимфоцитов и макрофагов, в настоящее время претерпел существенное переосмысление. Убедительно доказано, что цепь иммунологических реакций включает ряд дополнительных звеньев, которые первоначально не рассматривались в качестве компонентов иммунного ответа. В этой связи особый интерес представляет роль эндотелиальных клеток в развитии иммунных реакций, лежащих в основе формирования системной воспалительной реакции на экстремальную агрессию [17, 33, 41, 52].

Эндотелий сосудов выполняет многообразные функции, в том числе селективные транспортные и барьерные, участвует в метаболизме внеклеточного матрикса, биосинтезе разнообразных цитокинов (И.С. Фрейндлин, 1996, 1997–2003), регулирует процессы коагуляции и агрегации тромбоцитов. Целостность эндотелия сосудов, сохранение избирательной проницаемости в отношении фагоцитов, тромбоцитов и факторов свертывания исключительно важны для нормального функционирования микроциркуляции и гемостаза.

Эндотелий сосудов представляет собой гормонально активную ткань, которую называют самой большой «эндокринной железой» человека. Если выделить из организма все клетки эндотелия, их вес составит около 2 кг, а общая протяженность — около 7 км, площадь эндотелия приблизительно равна 6 теннисным кортам.

Уникальное расположение клеток эндотелия на границе между циркулирующей кровью и тканями делает их наиболее уязвимыми для различных патогенных факторов, находящихся в системном и тканевом кровотоке. Именно эти клетки первыми встречаются с реактивными свободными радикалами, окисленными липопротеинами низкой плотности, гиперхолестеринемией, гипергликемией, различными цитокинами, малыми молекулами, в том числе и инфекционного происхождения.

Дисфункция эндотелия лежит в основе формирования синдрома полиорганных нарушений при критических состояниях. В этой связи объективизация эндотелиальной дисфункции в экстремальной медицине приобретает особое значение [13, 14, 16, 21].

Активность фактора фон Виллебранда. Фактор фон Виллебранда (von Willebrand factor — vWF) — многомерный гликопротеин – выполняет главную посредническую роль во взаимодействии компонентов плазменного и сосудисто-тромбоцитарного гомеостаза. Синтезируется в клетках сосудистого эндотелия и мегакариоцитах. Высвобождается в системный кровоток, и затем большая часть его кумулируется в эндотелиальных клеточных органеллах и α-гранулах тромбоцитов, из которых происходит его повторное высвобождение. Исследуют влияние плазменного vWF на агглютинацию тромбоцитов под воздействием ристомицина. Материал — цитратная капиллярная кровь пациента.

Показатели у здоровых лиц, принятые в качестве региональной нормы (по данным Б.Ф. Архипова, Л.З. Баркагана, Л.В. Марамзиной, 1982): 103,00 ± 4,30 %. Референтные величины: 80–120 %.

Диагностическое значение . Повышение уровня и активности vWF в плазме крови происходит при стимуляции или повреждении сосудистого эндотелия, индукции адгезии и агрегации тромбоцитов. Факторами повреждения эндотелия служат модифицированные липопротеиды, эндотелиотропные вирусы, иммунные комплексы, гемодинамические перегрузки, ишемия, гипоксия, воздействие гистамина, адреналина, фибрина, эндотоксинов, цитокинов (TNF-α, IL-1 β), свободных радикалов и т.д. (М. Ситникова, 2004). В соответствии с этими механизмами повышение уровня и активности vWF наблюдается при критических состояниях, а также в клинических ситуациях, сопровождающихся хроническим диссеминированным внутрисосудистым свертыванием крови (тромбинемия), повреждением эндотелия сосудистой стенки и активацией тромбоцитов, в том числе при иммунных и иммунокомплексных заболеваниях, диабетических ангиопатиях, ИБС, гипертонической болезни и т.д. [39]. W.F. Penny с соавт. (1991) и M.G. Conlan с соавт. (1993) установлено, что высвобождение vWF при этих патологиях пропорционально интенсивности повреждающего воздействия на сосудистый эндотелий. Принимая во внимание, что с позиций концепции системного воспалительного ответа в основе формирования ПОН при критических состояниях лежит универсальное повреждение сосудистого эндотелия, диагностическое значение выявления повышенного уровня активности vWF у больных, находящихся в критических состояниях, трудно переоценить.

Молекулы адгезии в диагностике нарушений иммунитета при критических состояниях

Нарушения микроциркуляции при критических состояниях обусловлены гуморальным и клеточным компонентами. Гуморальный компонент включает локальную активацию цитокинов IL-1, IL-2, IL-6, TNF-α, факторов свертывания, свободных радикалов, протеолитических ферментов, образование вазоактивных продуктов арахидоновой кислоты. Клеточный компонент состоит в активации лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов. И клеточные, и гуморальные компоненты взаимодействуют между собой и с адгезивными молекулами (АМ), количество которых увеличивается в крови пациентов в критических состояниях.

Молекулы клеточной адгезии — гетерогенная группа белков, которые постоянно присутствуют на мембране клеток (эндотелиоцитов, лейкоцитов, тромбоцитов). В настоящее время адгезивные молекулы делят на три большие группы (табл. 2): суперсемейство иммуноглобулинов — эндотелиальные Ig-подобные белки; интегрины — трансмембранные белки, расположенные на поверхности клеток и способные связываться с другими белками и передавать внеклеточные сигналы; селектины — комплементарные белки, располагающиеся на эндотелии (Е), тромбоцитах (Р), лейкоцитах (L).

Таблица 2. Адгезивные молекулы

Адгезивные молекулы обеспечивают следующие процессы. Для лейкоцитов: прикрепление к сосудистому эндотелию, трансмиграцию через эндотелий, прикрепление к экстрацеллюлярному матриксу (фибронектин, ламинин, коллаген). Для лимфоцитов: прикрепление друг к другу, реализацию хомминг-эффекта (миграцию Т- и В-зоны в периферических лимфоидных органах), прикрепление к антигенпрезентирующим клеткам. Для тромбоцитов: прикрепление к лейкоцитам, прикрепление к эндотелиоцитам.

Адгезивность увеличивается под воздействием лейкотриенов, факторов тромбоза, С5а-компонента комплемента, бактериального липополисахарида и некоторых цитокинов (IL-8).

Молекула адгезии может быть не только в связанной с мембраной форме. В циркулирующей крови содержатся растворимые изоформы, содержание которых увеличивается вследствие либо экспрессии белка, либо протеолитического отщепления, которое ведет к повреждению эндотелия. Так, при воспалении Р-селектин быстро экспрессируется активированными тромбоцитами, а тромбин, гистамин и свободные радикалы производят мобилизацию АМ в течение минут.

Растворимые формы АМ — это биологически активные вещества. Растворимая форма ELAM-1 избирательно связывается с клетками, у которых на поверхности имеются аналогичные молекулы. Эта же форма регулирует функцию нейтрофилов путем увеличения взаимодействия нейтрофила с эндотелием. Растворимая форма ICAM-1 способна связывать антиген клеточной адгезии, активируя противоположный процесс — деадгезию. Так, растворимая форма ICAM-1 может конкурировать с мембраносвязанной формой за лейкоцитарную АМ, предотвращая повреждение ткани. Растворимая форма GMP-140 способна ингибировать адгезию нейтрофилов к эндотелию, блокируя вызванную TNF активацию интегринового комплекса.

Для растворимых молекул адгезии ICAM-1 и GMP-140 определены механизмы, с помощью которых они оказывают противовоспалительное действие.

В настоящее время роль адгезивных молекул на различных этапах миграции лейкоцита при развитии воспаления представляется в виде так называемого каскада адгезии (рис. 1).

Рисунок 1. Роль молекул адгезии на различных этапах миграции лейкоцита при развитии воспаления (Л.В. Молчанова, В.В. Мороз, Г.Н. Дранник, 1999, адаптация авторов)

Каскад адгезии

I. Этап атаки. Под влиянием цитокинов на поверхности эндотелия и лейкоцитов появляются молекулы семейства селектинов. Под их воздействием лейкоцит замедляет движение, приближается к эндотелию и начинает «катиться» («rolling») по его поверхности, но не останавливается.

II. Этап активации (начальной адгезии). Фактор активации тромбоцитов, IL-8, селектины из эндотелиальных клеток оказывает воздействие на нейтрофилы, потенцируя их адгезию к эндотелию. В этом процессе также участвуют такие молекулы, как фибронектин, фибрин, фрагменты комплемента.

III. Этап адгезии (прикрепления). По мере приближения под влиянием хемокинов к месту воспаления лейкоциты прилипают к эндотелию (распластываются). Этому способствуют интегрины лейкоцитов и выделяемые эндотелиоцитами АМ: ICAM-I, ICAM-2, VCAM-1, MAdCAM-1.

IV. Этап трансэндотелиальной миграции. Лейкоциты при помощи интегринов и тромбоцитарно-эндотелиальной адгезивной молекулы проникают между клетками эндотелия, экспрессирующими ECAM-1, ICAM-I, VCAM-1.

V. Этап субэндотелиальной миграции. Лейкоциты, экспрессирующие АМ (интегрины, CD44), проникают из сосуда в ткани.

Для диагностики нарушений иммунитета у больных в критических состояниях имеет значение количественное определение АМ в плазме крови:

— как маркеров активности воспалительного процесса (T.M. Carlos, J.M. Harlan, 1994);

— как маркеров СПОН и ее прогноза (O.V. Hein и соавт., 1998).

Уровень растворимых молекул адгезии s-ICAM-1 может быть определен с использованием тест-систем для иммуноферментного анализа.

Показатели у здоровых лиц, принятые в качестве региональной нормы (по данным Т.И. Гавриленко с соавт., 2002): 76,90 ± 3,360 нг/мл.

Диагностическое значение. По данным G.P. Downey, L. Fialkow (1995), концентрация АМ в плазме крови может служить критерием исхода критического состояния. Так, концентрация s-ICAM-1 у больных с сепсисом, которые погибли, составила 1793 ± 1026 нг/мл, а у выживших — 786 ± 454 нг/мл. По мнению авторов, концентрация s-ICAM-1 выше 1000 нг/мл свидетельствует о высокой вероятности летального исхода.

По данным O.V. Hein с соавт. (1998), концентрация s-ICAM-1 при септическом шоке является маркером повреждения эндотелия и прогностическим фактором исхода септического шока. По данным A. Yaguchi с соавт. (1998), факторами прогноза СПОН можно считать эндотелиальный фактор роста, фактор 4 тромбоцитов.

Таблица 3. Клиническая значимость апределения цитокинов и молекул адгезии в диагностике синдромов критических состояний

Оксид азота в диагностике нарушений иммунитета при критических состояниях

Оксид азота (NO) — медиатор внутриклеточного и межклеточного взаимодействия, важнейший медиатор иммунной, сердечно-сосудистой, дыхательной, нервной, пищеварительной и мочеполовой систем (Р.И. Сепиашвили с соавт., 2001; О.В. Синяченко, Т.В. Звягина, 2001). Все многообразие биологических эффектов NO можно разделить на 3 типа (Г.А. Рябов, Ю.М. Азизов, 2001):

— регуляторное влияние NO на сосудистый тонус, адгезию клеток, проницаемость сосудов, нейротрансмиссию, бронходилатацию, агрегацию тромбоцитов, систему противоопухолевого иммунитета, функцию почек;

— защитное действие NO, проявляющееся в его антиоксидантной активности, ингибировании адгезии лейкоцитов и защите от токсического воздействия TNF-α;

— повреждающее действие NO, выражающееся в ингибировании ряда ферментов, нарушении структуры ДНК, индукции процессов перекисного окисления липидов, снижении антиоксидантного потенциала клеток, повышении их чувствительности к радиации, алкилирующим агентам и токсичным ионам металлов.

NO вырабатывается различными клетками организма — эндотелиоцитами, эпителиоцитами, мезангиоцитами, миоцитами, лимфоцитами, нейтрофилами, тромбоцитами, макрофагами, моноцитами, фибробластами, нейронами, гепатоцитами, тучными клетками — и контролирует в них многие функции и биохимические процессы (Р.И. Сепиашвили с соавт., 2001; О.В. Синяченко, Т.В. Звягина, 2001).

В свободном состоянии NO — бесцветный газ, не имеющий запаха и обладающий высокой реакционной способностью. NO представляет собой двухатомную свободнорадикальную молекулу массой 28 Д. Отсутствие заряда и малые размеры молекулы обеспечивают ее липофильность и высокую проницаемость через мембраны клеток и субклеточных структур. Среднее время жизни NO в биологических тканях составляет 5,6 с. Наличие одного электрона с неспаренным спином придает молекуле NO высокую реакционную способность с широким спектром биологического действия. В основе многих биохимических феноменов NO лежат три основные реакции:

— взаимодействие с гемовым и негемовым железом;

— реакции с SH- и NH₂-группами и участие в свободнорадикальных процессах (Г.А. Рябов, Ю.М. Азизов, 2001).

В организме NO синтезируется в процессе окисления L-аргинина гемсодержащим ферментом NO-синтазой (NOS). Идентифицированы три изофермента NOS, которые кодируются разными генами и различаются структурой, распределением, функцией и регуляцией.

Нейрональная (nNOS, I тип) и эндотелиальная (eNOS, III тип) NO-синтазы представляют собой конститутивные ферменты, экспрессированные в эндотелиоцитах, нейронах, тромбоцитах, нейтрофилах и других клетках. Их активность зависит от присутствия кальция-кальмодулина и обеспечивает нейропередачу в нитритергических нейронах, релаксацию кровеносных сосудов и гладкомышечных органов, антиадгезию и антиагрегацию циркулирующих клеток крови, регуляцию синетеза и секреции гормонов (Р.И. Сепиашвили с соавт., 2001).

Индуцибельная NOS (iNOS, II тип) быстро экспрессируется под воздействием бактериальных продуктов, воспалительных цитокинов и активных форм кислорода в иммунных, эндотелиальных, гладкомышечных и других клетках, обеспечивая синтез значительно большего количества NO, чем конститутивные изоформы (О.В. Синяченко, Т.В. Звягина, 2001). Активность iNOS не зависит от присутствия кальция. Основной функцией продуцируемого ею NO является участие в иммунных процессах, таких как антипатогенные реакции, неспецифическая цитотоксичность, противоопухолевая защита, отторжение трансплантата и др. (Г.А. Рябов, Ю.М. Азизов, 2001). В норме iNOS практически не обнаруживается в клетках. Однако ее синтез индуцируется под действием провоспалительных цитокинов — IFN-γ, TNF-α и бактериального липополисахарида.

Роль оксида азота при инфекционной патологии

Защита от возбудителей инфекций — одна из важнейших функций иммунной системы. Патоген, попадая в организм, вызывает сложный комплекс иммунных реакций, направленных как на элиминацию возбудителя, так и на деструкцию клеток организма хозяина. NO при этом выполняет как регуляторные, так и эффекторные функции, оказывая протективное или тканеповреждающее воздействие в зависимости от стадии иммунного ответа (C. Bogdan с соавт., 2000).

При внеклеточной локализации возбудителя основную роль играет триада: нейтрофил, иммуноглобулин (опсонин), комплемент. При внутриклеточной локализации патоген недоступен для антител и ведущая роль в его уничтожении принадлежит триаде: Т-лимфоцит, NK-клетки (естественные киллеры), макрофаги (Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин, 1997). Участие оксида азота (NO) на основных этапах противоинфекционной защиты демонстрируется на рис. 2.

Рисунок 2. Участие оксида азота (NO) в иммунологических механизмах противоинфекционной защиты (по Р.И. Сепиашвили с соавт., 2001)

Фагоцитоз и синтез NO осуществляют активированные макрофаги и нейтрофилы. В первые 4 ч после попадания возбудителя в организм человека включаются неспецифические механизмы врожденного иммунитета, в реализации которых принимают участие нейтрофилы, макрофаги, NK-клетки, система комплемента (по альтернативному пути). Микробы поглощаются и разрушаются фагоцитами — макрофагами и нейтрофилами. Активация фагоцитов индуцирует выработку ими провоспалительных цитокинов. При этом TNF-α и IL-12 стимулируют NK-клетки, которые начинают синтезировать IFN-γ. TNF-α и IFN-γ активируют iNOS в иммунокомпетентных клетках. Особо следует отметить роль NO в эрадикации внутриклеточных инфекций, когда клетки-хозяева (моноциты, макрофаги), несущие внутриклеточный патоген-возбудитель, защищены от гуморальных агентов и лекарственной терапии. Большинство этих бактерий (Chlamidia, Francisella, Listeria, Mycobacterium, Toxoplasma) и простейшие (Entamoeba, Leishmania, Plasmodium и Trypanosoma) проявляют исключительную чувствительность к NO-зависимым защитным процессам в инфицированном организме (С.Я. Проскуряков с соавт., 2000). В ранней фазе иммунного ответа NO, помимо эффекторных, выполняет и важные регуляторные функции. Так, в течение первых часов инфицирования внутриклеточным патогеном Leishmania major локальная активация iNOS/NO не только обеспечивает антимикробное действие, но также контролирует функцию NK-клеток и экспрессию IFN-γ. NO является важным условием для передачи сигналов цитокинами и нормального функционирования механизмов врожденного иммунитета (F.C. Fang, 1997).

Ранний ответ адаптивного иммунитета (4–96 ч после внедрения возбудителя) сопровождается распознаванием антигена, рекрутированием и активацией эффекторных клеток.

Поздний адаптивный ответ на инфекцию (после 96 ч) сопровождается антигенспецифической пролиферацией Т- и В-лимфоцитов с дифференцировкой их в эффекторные клетки. В этой фазе происходит синтез антител (IgM, IgA), активация комплемента по классическому пути, Т-клеточная активация макрофагов с помощью IFN-γ.

С одной стороны, NO активно участвует в подавлении и элиминации возбудителей инфекционных болезней, с другой — избыточное повышение концентрации этого свободного радикала играет важную роль в повреждении тканей, развитии токсико-инфекционного шока, транслокации бактерий и полиорганной недостаточности (Р.И. Сепиашвили с соавт., 2001).

NO в патогенезе токсико-инфекционного шока

Среди многочисленных патологических состояний, в развитии которых важная роль принадлежит NO, особое место занимает септический шок. Под воздействием провоспалительных цитокинов — IFN-γ, TNF-α, бактериальных эндотоксинов, а затем и интерлейкинов-6, -8 активируется iNOS и в течение длительного времени синтезируется избыточное количество NO, вызывающего выраженную вазодилатацию, обусловленную активацией гуанилатциклазы и образованием циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) (М.Ю. Киров с соавт., 2000). В условиях системной воспалительной реакции резко возрастает продукция супероксиданиона макрофагами и полиморфноядерными нейтрофилами (П.П. Голиков с соавт., 2000). Отмечается быстрая сопряженная реакция между оксидом азота и супероксиданионом с образованием пероксинитрита (ONOO – ) (Р.И. Сепиашвили с соавт., 2001). Пероксинитрит обладает гораздо большей реакционной способностью, чем NO или супероксиданион, является сильным ДНК-расщепляющим агентом и стимулирует апоптоз и мутацию различных клеток, подавляет транспорт электронов в митохондриях (Г.А. Рябов, Ю.М. Азизов, 2001).

Развернутая картина септического шока характеризуется системной гипотензией, рефрактерной к катехоламинам, гипоперфузией тканей на фоне повышенной проницаемости эндотелия.

Эффекты NO могут быть частично нейтрализованы путем применения метилтионина или метиленового синего, механизм действия которого обусловлен неселективным ингибированием цГМФ и iNOS (М.Ю. Киров с соавт., 2000).

Так, метиленовый синий, вводимый болюсно в дозе 1–2 мг/кг пациентам с септическим шоком, приводил к повышению уровня АД, системного со судистого сопротивления, восстановлению чувствительности адренорецепторов к катехоламинам и нормализации плазменных концентраций цГМФ и продуктов метаболизма NO, нитратов и нитритов, улучшал сократительную способность миокарда и газообмен и может быть использован для коррекции сосудистой недостаточности при септическом шоке (М.Ю. Киров с соавт., 2000).

Методы оценки метаболизма оксида азота. Определение в биологических жидкостях нитритов / нитратов

Суточная продукция NO одним только эндотелием составляет 1,7 ммоль, а базальная концентрация его в плазме приближается к 3 нмоль. Уровень NO для клеток эндотелия оценивается в 4 пмоль/мин на 1 мг белка (Т.В. Звягина, 2002). Вследствие быстрого перехода в нитраты и нитриты свободный радикал NO имеет короткий период полужизни (5–30 с), что объясняет трудности его выявления в биологических жидкостях (Т.В. Звягина, 2002).

Сумму конечных продуктов метаболизма NO (нитритов (NO₂) / нитратов (NO₃)) в биологических жидкостях (кровь, моча, перитонеальная, бронхоальвеолярная, синовиальная жидкости, конденсат выдыхаемого воздуха) определяют по L.C. Green с соавт. с учетом рекомендаций О.М. Драпкиной, Н.В. Кулаковой (Т.В. Звягина, 2002). Поскольку NO₂ является неустойчивым анионом и легко окисляется до NO₃, для определения суммы метаболитов NO нитрат-ион восстанавливают с помощью металлического кадмия, импрегнированного медью, до нитрит-иона, содержание которого определяют с помощью реактива Грейса (Т.В. Звягина, 2001).

Исследуя кровь, ее центрифугируют в течение 5 мин (2000 об./мин). Сыворотку можно замораживать и хранить до измерения показателей при t = –30 °С.

Уровень суммы метаболитов NO (мNO) (нитритов / нитратов) в сыворотке крови определяют количественно спектрофотометрически при длине волны 540 нм после построения калибровочной кривой для оптической плотности стандартных растворов NaNO₂ в диапазоне концентраций от 0 до 150 мкмоль.

Показатели у здоровых лиц, принятые в качестве региональной нормы (по данным авторов): 4,4 ± 0,10 мкмоль/л. Референтные величины: 4,08–4,56 мкмоль/л.

Апоптоз и некроз клеток периферической крови при критических состояниях: суправитальная диагностика и ее клиническое значение

Апоптоз и некроз — два разных механизма (варианта) отмирания индивидуальных клеток тканей, органов человека и животных. Эти варианты характеризуются различными морфологическими и молекулярными явлениями и разным влиянием на окружающие ткани (C.D. Thompson, 1995; A.H. Wyllie и соавт., 1980).

Некроз — наиболее частая неспецифическая форма гибели клеток, запускается преимущественно внешними факторами и является случайным процессом (К.С. Казначеев, 1999). Патологическая гибель клетки (некроз), как правило, происходит в случае, когда клетки подвергаются действию экстремальных факторов (прямая травма, радиация, гипоксия, гипертермия, токсины, литические вирусы и др.) (А.А. Фильченков, Р.С. Стойка, 1999). При некрозе в процесс клеточной гибели вовлекается одновременно большое число клеток. Некроз может инициироваться продуктами распада клеток, а локализация процесса наступает только через развитие воспалительных изменений (Н.Н. Белушкина, С.Е. Северин, 2001).

Некроз обычно начинается с повреждения цитоплазматической мембраны, которое приводит к нарушению способности клеток сохранять свой ионный гомеостаз. Вследствие поступления в клетку избытка молекул воды и ионов из внеклеточного пространства происходит набухание не только клетки, но и некоторых органелл, в первую очередь митохондрий. Из-за разрывов плазматической мембраны содержимое цитоплазмы, включая лизосомальные ферменты, попадает во внеклеточное пространство, вызывая значительные повреждения ткани и развитие воспалительного процесса. Разрушение клетки происходит путем ее лизиса. Биохимические процессы, происходящие во время некроза клеток, не требуют энергии и могут осуществляться даже в условиях низких температур (+4 °С). Морфологические изменения в ядре некротической клетки обнаруживаются не так быстро, как во время апоптоза.

Апоптоз — физиологическая, генетически запрограммированная клеточная смерть, активный процесс самоликвидации («самоубийства») клетки, вызываемый внутренними или внешними сигналами. К экзогенным факторам относят физические (ионизирующее и ультрафиолетовое излучения), химические (оксиданты, токсины и др.) стимулы. К эндогенным — гормоны, цитокины, дериваты арахидоновой кислоты, прямые межклеточные контакты (А.Н. Маянский с соавт., 1997).

В современном понимании термин «апоптоз» был предложен J.F.R. Kerr с соавт. в 1972 г. Термин «запрограммированная гибель клетки» впервые был использован R.A. Lockshin, C.M. Williams в 1965 г. Исследователями 80–90-х гг. ХХ в. установлено, что в клетках организма существует генетическая программа, которая обеспечивает определенный по времени жизненный цикл и при определенных физиологических или патологических условиях включает программу гибели клетки. Было выяснено, что апоптоз является такой же фундаментальной генетической программой, как пролиферация, дифференциация или пребывание клеток в покоящемся состоянии (А.Н. Маянский с соавт., 1997; Г.Н. Дранник, 1999). Путем программированной клеточной гибели происходит удаление клеток, выживание которых нежелательно для организма, например мутантных клеток или клеток, зараженных вирусом. В последнем случае этот процесс имеет важное биологическое значение, поскольку фрагментация ДНК предупреждает перенос генетического материала вируса в другие клетки (Н.Н. Белушина, С.Е. Северин, 2001).

Апоптоз — активный процесс, требующий затрат энергии, транскрипции генов и синтеза белка de novo. Применение ингибиторов этих процессов приводит к ингибированию апоптоза. Аналогичной зависимости в случае некротической гибели клетки нет (J.S. Amenta, F.M. Baccino, 1989; M.K. Bach, 1995).

Наиболее характерными морфологическими изменениями при апоптозе являются: агрегация хроматина, конденсация ядра и цитоплазмы, а также фрагментация ядра и цитоплазмы на покрытые плазматической мембраной везикулы (апоптотические тельца), которые содержат конденсированный ядерный материал, митохондрии и рибосомы. In vivo апоптотические тельца быстро выявляются и подвергаются фагоцитозу макрофагами и соседними эпителиальными клетками. Это удаление апоптотических телец in vivo не сопровождается воспалительным процессом (А.А. Фильченков, Р.С. Стойка, 1999). Во время апоптоза клеток определенного типа отмечается выраженная вакуолизация цитоплазмы.

В отличие от некроза апоптоз встречается не только в патологически измененных, но и в нормальных тканях. У взрослых млекопитающих апоптоз обнаруживается как в тканях с медленной пролиферацией клеток (эпителий протоков печени, простаты, надпочечников), так и в тканях, клетки которых постоянно обновляются (эпителий ворсинок кишечника, клетки крови, сперматогонии).

Апоптоз играет очень важную роль в функционировании иммунной системы (А.Н. Чередеев, Л.В. Ковальчук, 1997). Яркий пример — удаление аутореактивных Т-клеток в тимусе и селекция В-клеток в лимфоидных фолликулах. С помощью апоптоза удаляются стареющие нейтрофильные лейкоциты и мегакариоциты, потерявшие большую часть цитоплазмы во время образования тромбоцитов.

Апоптоз в отличие от некроза является иммунологически инертным процессом, который не вызывает развития воспалительной реакции.

Наиболее характерные свойства некроза и апоптоза представлены в табл. 4.

Таблица 4. Сравнительная характеристика апоптоза и некроза клеток (А.А. Фильченков, Р.С. Стойка, 1999)

Все изменения, происходящие в клетке во время апоптоза, можно разделить на 2 фазы:

— фаза обратимых изменений, во время которой процесс апоптоза может быть остановлен и клеточные структуры будут репарированы (Y. Hannum,1997; К.С. Казначеев, 1999);

— необратимая фаза, во время которой клеточные структуры разрушаются и клетка образует апоптотическое тельце (Y. Hannum,1997).

В апоптозе, вызванном действием на клетки бактериальных токсинов, как правило, участвуют нейтрофилы, макрофаги и лимфоциты [62, 69]. Причем лимфоциты необходимы не только для ликвидации поврежденных клеток, но и для разрушения бактериального патогена (J.C. Reed, 1997).

Особый интерес для медицины неотложных состояний представляет суправитальное (прижизненное) изучение типа некробиоза (апоптоза / некроза) лейкоцитов, в частности нейтрофилов, как циркулирующих, так и экссудативных (Н.А. Маянский с соавт., 2000). Нейтрофилы принадлежат к клеткам с наиболее коротким периодом жизни. Они циркулируют в крови около 10 ч и, перейдя в ткани, погибают через 3–5 дней.

По данным А.Н. Маянского с соавт. (1993, 2000); S.C. Frasch с соавт. (1998), усиление апоптоза нейтрофилов вызывают: TNF-α, перекись водорода, гепарин, протеолитические ферменты, сульфосалазин, гипертермия, фагоцитоз бактерий, ультрафиолетовое облучение. По мнению М.Г. Винокурова с соавт. (2001), весьма вероятно, что одним из звеньев лечебного эффекта УФОК может быть ускорение апоптоза нейтрофилов.

Антиапоптозный эффект вызывают IL-1 γ, IFN-β, PAF, IL-2, -4, глюкокортикостероидные гормоны, ЛПС грамотрицательных бактерий.

Нейтрофилы способны противостоять не только спонтанному, но и индуцированному апоптозу — IL-8 отменяет апоптогенное действие TNF-α (R. Kettritz и соавт., 1998). IL-10 блокирует антиапоптозное действие IFN-γ, ЛПС, ГМ-КСФ (M. Keel и соавт., 1997). Дексаметазон усиливает задержку апоптоза, индуцированного ГМ-КСФ, но не ЛПС (G. Cox,1995).

Задержка спонтанного апоптоза нейтрофилов наблюдается у больных с септическим синдромом на фоне пневмонии, ожогов и травм (D. Chitnis и соавт., 1996; W. Ertel и соавт., 1998; M.F. Jimmenez и соавт., 1997; M. Keel и соавт., 1997), после полостных операций (M. Keel и соавт., 1997; E. Kobayashi, H. Yamauchi, 1997). Задержка апоптоза, продлевающая жизнь активированных нейтрофилов, может способствовать развитию полиорганных нарушений, типичных для сепсиса (А.Н. Маянский с соавт., 1999).

Факторы, влияющие на апоптоз нейтрофилов, могут возникать при любых стрессовых ситуациях, в том числе под влиянием стимулов, исходящих из очагов воспаления. В плазме больных с ожогами обнаружены ингибиторы апоптоза. Ингибиторы нейтрофильного апоптоза выявлены также в сыворотке больных с септическими посттравматическими (W. Ertel с соавт., 1998; E.R. Goodman с соавт., 1998) и послеоперационными (M.F. Jimmenez с соавт., 1997) осложнениями.

Влияние патологических состояний на апоптоз нейтрофилов может быть опосредованно и через стрессзависимую перестройку гормонального статуса, прежде всего через глюкокортикоидные гормоны, угнетающие апоптоз нейтрофилов (А.Н. Маянский с соавт., 1999).

При ряде вирусных инфекций, в частности при ВИЧ-1, аденовирусной, Эпштейна — Барр, бакуловирусной инфекции, инфицированные клетки защищаются от апоптоза, тогда как гибель неинфицированных клеток иммунной системы может привести к тяжелой иммуносупрессии (Л.В. Ковальчук, А.Н. Чередеев, 1998).

В качестве важного аспекта старения иммунной системы человека наряду с многочисленными факторами следует рассматривать и высокую степень запрограммированной клеточной гибели, в первую очередь Т-лимфоцитов. Вероятно, высок процент апоптоза клеток иммунной системы под влиянием лекарственных препаратов (глюкокортикостероидов, иммунодепрессантов и др.). Применение этих препаратов играет существенную роль в подавлении иммунных процессов при аутоиммунной патологии, но может оказаться фатальным фактором при иммунодефицитных состояниях.

Эти и многие другие факторы позволили выделить в самостоятельную группу иммунодефициты, как первичные, так и приобретенные, в основе которых лежит интенсивный прогрессирующий апоптоз клеток иммунной системы, в первую очередь лимфоцитов (Л.В. Ковальчук, А.Н. Чередеев, 1998).

В настоящее время в клинической практике для оценки апоптоза используют следующие методические приемы:

— морфологический (обычная световая и электронная микроскопия, проточная цитофлюорометрия, лазерная сканирующая цитометрия);

— биохимический с выявлением биохимических изменений в плазматической мембране путем проточной цитофлуорометрии, в цитоплазме и митохондриях путем проточной цитофлуорометрии, спектрофотометрии, флуориметрического анализа, иммуногистохимии и иммуноцитохимии, в ядре путем лазерной сканирующей цитометрии, иммуноферментного анализа (А.А. Фильченков, Р.С. Стойка, 1999).

Существует мнение, что морфологические изменения становятся видимыми при световой микроскопии только с началом необратимых изменений в ядре и цитоплазме (Y. Hannum, 1997; К.С. Казначеев, 1999). Изменения на ранних стадиях можно выявить только с помощью дополнительных (биохимических) лабораторных методик.

Наряду с этим возможно определение жизнеспособности клеток реакцией с трипановым синим. Данный метод технически несложен, но малоинформативен, поскольку исследуемая популяция разделяется на живые и мертвые клетки. Апоптотические клетки вплоть до потери функции мембраны определяются данным методом как живые.

Определение активности лизосомальных ферментов и НСТ-тест также дают только косвенные указания на процессы апоптоза, идущие в клетке. При использовании этих методик невозможно установить причину повышенной активации ферментов и генерации свободных кислородных радикалов (К.С. Казначеев, 1999). Лизосомальные ферменты — маркеры процесса некробиоза. Длительное увеличение активности лизосомальных ферментов, очевидно, является молекулярным признаком синдрома системного воспалительного ответа, в частности прижизненного некробиоза (В.Л. Кожура,1999).

Таким образом, на сегодняшний день существует реальная возможность идентификации клеток иммунной системы, подвергающихся апоптозу. На основании учета апоптотических процессов в лимфоцитах можно сделать заключение о патогенетических механизмах приобретенных иммунодефицитов, устанавливать стадию иммунного дистресс-синдрома при критических состояниях [1, 18, 20, 38, 40].

Рисунок 3. Апоптоз нейтрофильных гранулоцитов: клетка в центре несколько уменьшена в размерах, цитоплазма её уплотнена, хроматин конденсирован, ядро фрагментировано (Мазок венозной крови. Световая микроскопия. Увеличение в 1000 раз. Окраска по Романовскому — Гимзе. Фото А.Н. Нестеренко, А.В. Седых)

Уровень коммитированных к апоптозу нейтрофилов и некротически измененных гранулоцитов определяли в венозной крови. Гепаринизированную венозную кровь с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина культивировали в термостате при 37 °С. Через 6 ч учитывали коммитированные к апоптозу лейкоциты и некротически измененные гранулоциты путем световой микроскопии в тонких мазках крови, окрашенных по Романовскому — Гимзе (рис. 3). Известно, что результаты морфологического анализа хорошо коррелируют с данными других методов оценки апоптоза (M.-J. Herbert с соавт., 1996; D.A. Moulding с соавт., 1998; J.S. Savill с соавт., 1989).

Показатели у здоровых лиц, принятые в качестве региональной нормы (по данным А.Н. Нестеренко, А.В. Седых, 2004): коммитированные к апоптозу нейтрофилы — 11,20 ± 0,723 ‰; некротически измененные нейтрофилы — 44,80 ± 4,60 ‰.

Диагностическое значение. У выживших больных с тяжелым хирургическим сепсисом мы отметили увеличение в сравнении с нормой числа коммитированных к апоптозу нейтрофилов при незначительном увеличении в сравнении с нормой числа некротически измененных клеток.

У больных с хирургическим сепсисом, получавших на стадиях инициации SIRS и иммунотоксикоза адекватную тяжести состояния интенсивную терапию с иммунокоррекцией (диклофенак, ингибитор TNF пентоксифиллин, анаболизирующие стероиды, индукторы IFN: циклоферон, дипиридамол, амизон; IgN, ВЛОК, УФОК, антибиотики), мы наблюдали увеличение доли коммитированных к апоптозу нейтрофилов в 1,7 раза в сравнении со значением нормы.

Для больных, умерших от СПОН вследствие тяжелого хирургического сепсиса в фазу иммунопаралича, подтвержденного на аутопсии, было характерно уменьшение числа коммитированных к апоптозу нейтрофилов и увеличение доли некротически измененных клеток, что сочеталось со снижением уровня апоптогенных цитокинов: уровень TNF-α был ниже нормы (76,90 ± 3,36 пг/мл) в 2,5–4,7 раза, достигая 16 пкг/мл [1, 18, 20, 38].

Окончание в №4