Журнал «Внутренняя медицина» 2(8) 2008

Живий організм — це ексклюзивна інтегрована колекція диференційованих клітин, що балансують між життям та смертю. Для кожної клітини є час жити та час помирати. Довго будь-яку смерть клітини називали некрозом. Однак зараз уже відомо, що загибель клітини може бути обумовлена й іншим механізмом, що отримав назву «апоптоз» [10, 16].

Апоптоз — це енергетично-залежний процес, що управляється генетичною програмою, у результаті якого відбувається фрагментація ДНК та клітина ділиться на невеличкі апоптотичні тільця [2, 4, 17]. Слід зазначити, що оскільки цілісність клітинної мембрани зберігається, внутрішньоклітинний уміст не потрапляє в міжклітинний простір, і тому не спостерігається типової для некрозу запальної реакції.

За певних умов клітина здатна автономно ініціювати свою загибель («суїцидальна програма»), проте в ряді випадків цей процес може стимулюватися екзогенними факторами, одними з яких є родина прозапального цитокіну — фактору некрозу пухлини α (ФНП-α). Члени родини ФНП-α взаємодіють із відповідними рецепторами, що утворюють родину ФНП-Р, до їх числа входять ФНП-Р1 (ФНП-α рецептор 1-го типу, Fas (Fibloblast associated), відомий також під назвою APO-1 (APOptosis-1), та ін. [2, 3, 16].

Серед членів родини ФНП-Р вирізняють рецептори, що характеризуються наявністю 80 амінокислотних цитоплазматичних доменів, саме які й запускають інтрацелюлярний апоптотичний сигнальний каскад. Тому вони отримали назву «домен смерті» (Death Domain — DD) [1]. Шість рецепторів, що містять такі «домени смерті», які здатні опосередковувати передачу проапоптотичного сигналу, було названо «рецептори смерті» (Death Receptors — DR) (табл. 1).

Передача сигналу через «рецептори смерті» залучає унікальний ланцюг протеїнів, що не є частиною інших сигнальних шляхів трансдукції. Ліганди, що активують «рецептори смерті», належать також до суперродини ФНП-α та являють собою схожі за структурою молекули. Слід підкреслити, що хоча обидва рецептори — ФНП-Р1 та ФНП-Р2 можуть брати участь у зв’язуванні цього «ліганду смерті», передача проапоптотичного сигналу частіше за все здійснюється через ФНП-Р1 [3, 5, 12].

Рецептор Fas індукує апоптотичний сигнал шляхом зв’язування зі своїм лігандом — Fas-лігандом (FasL) [1, 2]. FasL існують у двох формах — мембранозв’язаній (mFasL) та розчинній (sFasL). Мембранозв’язана форма перетворюється на розчинну під впливом металопротеїнази матрилізину [9]. Такий механізм утворення розчинних форм шляхом відокремлення від молекул-попередників, зв’язаних із мембраною, є характерним для багатьох представників родини ФНП-α (наприклад, механізм утворення розчинних форм ФНП-Р). Отже, передача проапоптотичного сигналу може здійснюватися Fas-залежним та ФНП-Р1-залежним шляхом [1, 8].

Апоптоз має широке біологічне значення. Це складний активний процес, у результаті якого здійснюється фізіологічно запрограмована загибель клітин при ембріогенезі та нормальній життєдіяльності тканин для підтримки клітинного гомеостазу організму. З іншого боку, апоптоз відіграє важливу роль при патологічних станах, що обумовлені впливом різноманітних ушкоджуючих факторів. Зокрема, показано його значення при окремих серцево-судинних захворюваннях: інфаркті міокарда, реперфузійному ушкодженні, серцевій недостатності та ін. [4, 14, 16].

У літературі знайдено незначну кількість клінічних робіт, присвячених вивченню плазматичних маркерів апоптозу при серцево-судинній патології. Обмеженість кількості досліджень може бути пояснена технічною складністю методів визначення апоптозу. Найбільш переконливим доказом є пряме визначення у зразках тканин апоптотичних тілець, що містять ядра з характерними ознаками апоптозу, які краще за все візуалізуються при електронній мікроскопії. Однак через те що апоптотичні тільця фагоцитуються впродовж кількох годин після загибелі клітини, виникають певні труднощі при їх визначенні. Більше того, програмована клітинна загибель — це процес, що протікає асинхронно, може уражати обмежену кількість клітин, або спостерігається скупчення групами разом із некрозом [10]. Тому для верифікації апоптозу у препаратах міокарда, а також ендоміокардіальних біоптатах використовується TUNEL-метод (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick End-Labeling), що є комбінацією молекулярно-біологічної, гісто- та цитохімічної методик [4]. TUNEL-метод має й деякі недоліки. По-перше, TUNEL-позитивними можуть бути не тільки апоптотично-фрагментовані ядра ДНК (наприклад, неспецифічні ушкодження ДНК або відновлення ДНК), що потенційно обмежує специфічність цієї методики. По-друге, цей метод є складним, по-третє — дорогим, що обмежує його використання у клінічній практиці. Крім того, через те що фрагментація ДНК — це пізня подія в апоптотичному процесі, продовжується пошук маркерів, які дозволять визначати клітини, що знаходяться на ранніх стадіях апоптозу.

Поряд з інвазивними методами прямого визначення дефрагментованих апоптотичних ДНК виникли нові підходи до діагностики такого виду загибелі клітин. Це методи, що базуються на вивченні специфічних частин апоптотичного каскаду, наприклад активності ФНП-α, рФНП-Р1 та sFas/sFasL-системи. Таке визначення циркулюючих маркерів апоптозу у плазмі крові є більш прийнятним у клінічній практиці.

У зв’язку з цим метою нашого клінічного дослідження було вивчення дистанційних маркерів апоптозу — ФНП-α, рФНП-Р1 та sFasL у хворих на артеріальну гіпертензію залежно від рівня підвищення артеріального тиску.

Матеріал і методи дослідження

Обстежено 78 хворих на артеріальну гіпертензію (АГ), яким було проведено загальноклінічне та лабораторно-інструментальне обстеження. До групи контролю увійшли 22 практично здорові особи. Офісний артеріальний тиск (АТ) вимірювали в ранкові години в положенні пацієнта сидячи у стані спокою тричі з інтервалом дві хвилини. Аналізували середнє арифметичне значення систолічного АТ (САТ) та діастолічного АТ (ДАТ). Частоту серцевих скорочень визначали одразу після другого вимірювання АТ. Верифікацію діагнозу, визначення стадії та ступеня АГ проведено згідно з критеріями, рекомендованими Українським товариством кардіологів (2004 р.) та Європейським товариством з артеріальної гіпертензії/Європейським товариством з кардіології (2003 р.) [7]. Визначення рівня ФНП-α та рФНП-Р1 у плазмі крові пацієнтів проводилося імуноферментним методом за допомогою наборів реагентів ProCon TNF-α («Протеиновый контур», С.-Петербург, Россия), sTNF-RI EASIA (BioSource Europe S.A., Belgium). Згідно з методиками, рівень ФНП-α у здорових осіб не перевищує 50 пг/мл; рівень рФНП-Р1 коливається від 0,3 до 2,9 нг/мл при середньому значенні, що визначено у 129 здорових осіб, 1,2 ± 0,6 нг/мл. Уміст sFasL у плазмі крові визначено тест-системою Human sFas Ligand ELISA (Bender MedSystems, Vienna, Austria).

До дослідження не включали пацієнтів із вторинною артеріальною гіпертензією, супутньою онкопатологією, гострими та хронічними запальними захворюваннями та цукровим діабетом.

Статистичну обробку отриманих даних проведено стандартними методами варіаційної статистики з використанням пакету статистичних програм Statistica 6.0. Результати наведено як M ± m, де М — середнє значення показника, m — стандартна похибка. Вірогідність розбіжностей між досліджуваними показниками визначалася за допомогою двовибіркового t-критерію Стьюдента та критерію згоди χ². Для дослідження взаємозв’язку між показниками проведено кореляційний аналіз із розрахунком парних коефіцієнтів кореляцій Пірсона (r) та коефіцієнтів кореляції Спірмена (r_s).

Результати та їх обговорення

Середній вік обстежених пацієнтів становив 54,51 ± 1,07 року, що суттєво не відрізнялося від аналогічного показника контрольної групи — 49,91 ± 1,12 року. Тривалість АГ коливалася в широких межах — від одного місяця до 35 років, у середньому 9,64 ± 0,93 року. Середні значення АТ основної групи (хворі на АГ) характеризувалися такими показниками: САТ — 175,63 ± 2,59 мм рт.ст.; ДАТ — 105,87 ± 1,35 мм рт.ст.; контрольної групи: САТ — 121,25 ± 1,21 мм рт.ст.; ДАТ — 82,11 ± 0,54 мм рт.ст. Рівень ФНП-α в плазмі крові хворих на АГ (124,99 ± 13,26 пкг/мл) значно та вірогідно перевищував рівень контрольної групи (13,23 ± 3,40 пкг/мл, p = 0,003 згідно з двовибірковим t-критерієм Стьюдента). Плазматичний уміст рФНП-Р1 гіпертензивних пацієнтів (2,12 ± 0,08 нг/мл) також був вищим за контрольні значення (1,20 ± 0,60 нг/мл, p = 0,031 згідно з двовибірковим t-критерієм Стьюдента). Відсоток наявності індуктора апоптозу — sFasL у крові основної когорти пацієнтів виявився значним — 73 ± 5 % (57 осіб), при середньому значенні 0,38 ± 0,03 нг/мл (від 0 до 0,91 нг/мл).

У зв’язку з тим, що існують свідчення щодо підвищеної продукції прозапальних цитокінів у відповідь на гемодинамічне перевантаження тиском [6, 15], нами проаналізовано їх активність залежно від рівня АТ (табл. 2). Пацієнтів було розділено на три групи відповідно до ступеня АГ: 1-ша група (n = 18) — 1-й ступінь (САТ 140–159 мм рт.ст; ДАТ 90–99 мм рт.ст.), 2-га група (n = 25) — 2-й ступінь (САТ 160–179 мм рт.ст.; ДАТ 100–109 мм рт.ст.), 3-тя група (n = 35) — 3-й ступінь (САТ > 180 мм рт.ст.; ДАТ > 110 мм рт.ст.).

Пацієнти практично не відрізнялися за віком (p > 0,05 згідно з двовибірковим t-критерієм Стьюдента в усіх випадках). Середні значення тривалості захворювання були тим більшими, чим вищим був ступінь АГ (p < 0,05 згідно з двовибірковим t-критерієм Стьюдента в усіх випадках).

Встановлено, що середній рівень ФНП-α в плазмі крові пацієнтів усіх груп вірогідно перевищував середнє значення здорових осіб (контроль vs 1-ї групи, p = 0,00006; vs 2-ї групи, p = 0,00006; vs 3-ї групи, p = 0,00005 згідно з двовибірковим t-критерієм Стьюдента) (рис. 1).

Максимальний уміст даного цитокіну відзначено при 2-му ступені АГ (p = 0,010 vs 1-го ступеня згідно з двовибірковим t-критерієм Стьюдента). У пацієнтів із 3-м ступенем АГ рівень ФНП-α знижувався порівняно із хворими з 2-м ступенем АГ (p = 0,054 згідно з двовибірковим t-критерієм Стьюдента) та практично не відрізнявся від середнього рівня пацієнтів із 1 ступенем АГ (p = 0,163 згідно з двовибірковим t-критерієм Стьюдента).

Циркулюючий рівень рФНП-Р1 гіпертензивних пацієнтів усіх трьох груп був вірогідно вищим за середнє нормальне значення (p < 0,001 в усіх випадках згідно з двовибірковим t-критерієм Стьюдента) (рис. 2).

Аналіз динаміки вмісту рФНП-Р1 показав тенденцію зростання його вмісту паралельно підвищенню величини АТ (1-ша група vs 2-ї групи, p = 0,59; 1-ша група vs 3-ї групи, p = 0,36; 2-га група vs 3-ї групи, p = 0,75 згідно з двовибірковим t-критерієм Стьюдента).

Результати проведених в останні роки досліджень свідчать про те, що ФНП-α є медіатором кардіальної патології, що діє частково via запальні механізми та частково via активацію програмованої загибелі клітин — апоптозу [3, 5, 12]. Активовані макрофаги є основним джерелом біосинтезу цитокінів, у тому числі й ФНП-α. У серці біомеханічний стрес викликає посилену ендогенну продукцію цитокіну міоцитами та неміоцитарними типами клітин [6, 9], як це встановлено в нашому дослідженні хворих на АГ.

Зв’язування ФНП-α зі відповідними рецепторами призводить до формування мультимолекулярного сигнального комплексу, що швидко активує подальший каскад внутрішньоклітинних взаємодій. Показано, що в серці негативні інотропні ефекти ФНП-α медійовані активністю саме ФНП-Р1. Розчинні форми ФНП-Р1 є природними інгібіторами ФНП-α, що блокують його цитотоксичність [5, 12]. Встановлено зростання рФНП-Р1 у плазмі крові пацієнтів із вираженою серцевою недостатністю та інфарктом міокарда [13, 16, 17]. Нами отримано подібні результати щодо підвищення циркулюючого рівня рФНП-Р1 у хворих на АГ.

Величина ФНП-α/рФНП-Р1, що відображає співвідношення ліганд/рецептор, контрольної групи (практично здорові особи) становила 13,03 ± 2,83. Вивчення динаміки даного показника показало його зростання в пацієнтів із різним ступенем АГ порівняно зі здоровими особами (контроль vs 1-ї групи, p = 0,0004; vs 2-ї групи, p = 0,0001; vs 3-ї групи, p = 0,0006 згідно з двовибірковим t-критерієм Стьюдента). Максимальне значення виявлено в пацієнтів із 2-м ступенем АГ, що відображає більш значне зростання ФНП-α порівняно з його природним антагоністом — рФНП-Р1 (p = 0,34 vs 1-го ступеня АГ; p = 0,61 vs 3-го ступеня АГ згідно з двовибірковим t-критерієм Стьюдента). У пацієнтів із 3-м ступенем АГ спостерігалося незначне зниження величини ФНП-α/рФНП-Р1 порівняно з 2-м ступенем АГ, що, однак, залишалася вищою за таку пацієнтів із 1 ступенем АГ (p = 0,59 згідно з двовибірковим t-критерієм Стьюдента) та здорових осіб.

Кореляційний аналіз виявив позитивний взаємозв’язок між САТ та рФНП-Р1 (r_s = 0,41; p = 0,040) у пацієнтів із 2-м ступенем АГ; між ДАТ та ФНП-α (r_s = 0,51; p = 0,002), ФНП-α/рФНП-Р1 (r_s = 0,49; p = 0,003) у пацієнтів із 3-м ступенем АГ.

Отже, за нашими результатами, на початку захворювання (5,67 ± 1,07 року) при відносно незначному збільшенні рівня АТ (1-й ступінь АГ) відзначено зростання ФНП-α та рФНП-Р1. Відрив екстрацелюлярних частин ФНП-Р при високому циркулюючому рівні цитокіну можна розцінити як адаптивний механізм, що, з одного боку, зменшує кількість активних рецепторів на поверхні клітин-мішеней, а з іншого — шляхом зв’язування з ФНП-б ефективно нейтралізує його біоактивність. Надалі (7,52 ± 1,36 року) при підвищенні АТ (2-й ступінь АГ) відбувається більш виражене збільшення продукції ФНП-α. Паралельного зростання рФНП-Р1, як це спостерігалося в нашому дослідженні, можливо, недостатньо для нейтралізації негативної, у тому числі й проапоптотичної, дії цитокіну (підвищення співвідношення ФНП-α/рФНП-Р1). При максимальній тривалості захворювання (13,20 ± 1,56 року) та максимальному рівні АТ (3-й ступінь АГ) уміст ФНП-α знижувався, що, можливо, частково обумовлено його зв’язуванням із рФНП-Р1. З іншого боку, не виключена можливість того, що ФНП-α запускає апоптотичний каскад, що призводить до загибелі клітин — продуцентів цитокіну. Подальше зростання рФНП-Р1 на фоні зменшення ФНП-α начебто має сприятливе значення. Але той факт, що величина ФНП-α/рФНП-Р1, незважаючи на зниження, все ж таки перевищує величину співвідношення ліганд/рецептор у пацієнтів із 1-м ступенем АГ та здорових осіб, свідчить про те, що такий уміст рФНП-Р1 не в змозі інактивувати цитотоксичність ФНП-α.

Отже, незважаючи на виявлене нами підвищення концентрації рФНП-Р1, природного інгібітора ФНП-α, рівень цитокіну залишався високим, що не виключає наявності ФНП-Р1-залежного шляху реалізації апоптозу у хворих на АГ.

Альтернативним механізмом реалізації апоптотичної загибелі клітин є зв’язування рецептора Fas із відповідним лігандом (FasL). За даними нечисленних досліджень, уміст розчинного FasL, промотора формування Fas/FasL-комплексу, зростає у хворих на гострий інфаркт міокарда, постінфарктний кардіосклероз та застійну СН [11, 14]. Нами з’ясовано значну частоту виявлення sFasL у хворих на АГ, що залежала від ступеня АГ. Так, при 1-му ступені АГ відсоток визначення sFasL у плазмі крові становив 56 ± 12 % (10 пацієнтів); при 2-му ступені АГ частота була вищою — 76 ± 9 % (19 пацієнтів; p = 0,082 згідно з критерієм згоди χ²); при 3-му ступені АГ спостерігалася тенденція подальшого зростання частоти виявлення sFasL — 80 ± 7 % (28 пацієнтів; p = 0,75 vs 2-го ступеня АГ; p = 0,040 vs 1-го ступеня АГ з критерієм згоди χ²). Вивчення динаміки середнього рівня sFasL показало подібну тенденцію його підвищення (рис. 3).

Середні значення sFasL у плазмі крові пацієнтів із 2-м і 3-м ступенем АГ істотно не відрізнялися між собою (p = 0,97 згідно з двовибірковим t-критерієм Стьюдента) та були вищими за середній рівень при 1-му ступені АГ (p = 0,16; p = 0,10 згідно з двовибірковим t-критерієм Стьюдента).

Проведений кореляційний аналіз показав наявність позитивної залежності між віком пацієнтів та sFasL (r = 0,40; p = 0,048); негативної — між sFasL та ФНП-α (r = –0,55; p = 0,005), ФНП-α/рФНП-Р1 (r = –0,45; p = 0,023) у пацієнтів 2-ї групи, між sFasL та ФНП-α (r_s = –0,54; p = 0,0008), ФНП-α/рФНП-Р1 (r_s = –0,55; p = 0,0006) у пацієнтів 3-ї групи.

Виявлена нами значна частота sFasL та тенденція зростання його середнього рівня поряд зі збільшенням величини АТ вказує на вірогідність наявності Fas-залежного апоптозу у хворих на АГ.

Висновки

Результати нашого клінічного дослідження показали підвищення вмісту дистанційних маркерів апоптозу, активність яких залежала від рівня АТ, що свідчить про можливість як Fas-, так і ФНП-Р1-опосередкованого шляху активації апоптотичної загибелі клітин при АГ. Циркулюючі ФНП-α, рФНП-Р1 та sFasL можуть відігравати важливу роль як дистанційні маркери апоптозу при АГ.

Апоптоз кардіоміоцитів погіршує перебіг та прогноз АГ, бо сприяє переходу від адаптивної гіпертрофії до серцевої дисфункції. Тому можливість того, що блокування цього процесу дає змогу попереджати або уповільнювати прогрес СН, відкриває нові перспективи в лікуванні кардіальної патології.