Архив офтальмологии Украины Том 6, №3, 2018

Вступ

У метааналізі ряду широкогеномних асоціативних досліджень (GWAS): вісьмох, що було виконано у США (3853 випадки і 33 480 контролів), двох австралійських (1252 випадки і 2592 контролі), трьох європейських (875 випадків і 4107 контролів) та сінгапурського китайського дослідження (1037 випадків і 2543 контролі) — був виявлений новий поліморфний локус, асоційований із первинною відкритокутовою глаукомою (ПВКГ), — rs35934224 алель T гена TXNRD2; також була показана висока експресія гена TXNRD2 для гангліозних клітин сітківки і головки зорового нерва (optic nerve cupping) [1].

Роль порушень системи перекисної оксидації у виникненні ПВКГ загально визнана, а отримані при експериментальній глаукомі дані довели, що виснаження ензиматичної антиоксидантної системи сітківки та зорового нерву є пусковим механізмом апоптозу гангліонарних нейронів сітківки [2, 3].

Ген TXNRD2 кодує мітохондріальний білок тиоредоксинредуктазу 2, який необхідний для мітохондріального редокс-гомеостазу. Тиреодоксин 2 зменшує пошкоджувальну дію активних форм кисню, які утворюються внаслідок окислювального фосфорилювання [4]. В експерименті надмірна експресія тиреодоксину 2 мала захисний ефект [5]. Отже, зменшення кількості активних форм кисню за допомогою активації експресії гена TXNRD2 запобігає мітохондріальній дисфункції та апоптозу гангліозних клітин при ПВКГ [1].

Найбільш пов’язаний із ПВКГ, за даними метааналізу [1], поліморфізм rs35934224 гена TXNRD2, розташований у сайті зв’язування для NRSF (neuron-restrictive silencer factor), також відомий як REST (repressor element 1-silencing transcription factor), — транскрипційний фактор, що захищає нейрони від окисного стресу [6].

Виходячи з викладеного можна вважати, що вперше виявлена у великому матаналізі [1] асоціація поліморфізму rs35934224 гена TXNRD2 з ПВКГ послаблює зв’язок транскрипційного фактора NRSF з промотором гена, внаслідок чого має місце зниження експресії тиоредоксинредуктази 2 і, відповідно, зниження відновлення внутрішньомітохондріального антиоксиданту тиреодоксину 2, що й посилює окисне пошкодження та може ініціювати мітохондріальний механізм запуску апоптозу.

Дослідження генетичних складових патогенезу ПВКГ з вивченням поліморфізмів інших генів — TP53 та делеційних поліморфізмів гена глутатіон-S-трансферази в Україні вже проводилось [7, 8], але вивчення поліморфізму гена TXNRD2 проводиться вперше.

Мета дослідження — визначення зв’язку поліморфізму rs35934224 гена TXNRD2 з ПВКГ у хворих української популяції.

Матеріали та методи

Робота виконана на базі кафедри очних хвороб Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова та відділення офтальмології Вінницької обласної клінічної лікарні ім. М.І. Пирогова. Обстеження хворих та встановлення діагнозу ПВКГ проводили згідно з класифікацією периметричних змін за стадіями глаукоми А.П. Нестерова [9].

До дослідження включено 93 хворих (185 очей) з ПВКГ I–IV стадій та 89 добровольців (178 очей), у яких не було встановлено будь-якої глаукоми, вони ввійшли до контрольної групи. Хворих було розподілено на групи відповідно до ступеня периметричних змін [9] (табл. 1). Всім хворим виконано візометрію, комп’ютерну периметрію Humphrey, тонометрію, біомікроскопію, офтальмоскопію, гоніоскопію, кератопахіметрію, оптичну когерентну томографію зорового нерва.

Всі етапи молекулярно-генетичних досліджень було проведено у Науково-дослідному інституті експериментальної та клінічної медицини Національного медичного університету імені О.О. Богомольця. Аналіз поліморфізму rs35934224 гена TXNRD2 проведено методом полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі в автоматичному ампліфікаторі Gene Amp^® PCR System 7500 (Applied Biosystems, США). На першому етапі дослідження проводили виділення геномної ДНК з цільної венозної крові з використанням стандартних реактивів PureLink^® Genomic DNA Kit For purification of genomic DNA, виробник INVITROGEN (США). Аналіз поліморфізму здійснено з використанням уніфікованих тест-систем TaqMan Mutation Detection Assays Life-Technology (США). Для статистичного аналізу результатів використовували пакет MedStat і MedCalc v.15.1 (MedCalc Software bvba). Асоціацію генотипів та алелей з захворюванням визначали за величиною відношення шансів (ВШ); межі 95% довірчого інтервалу (ДІ) для ВШ розраховували за методом J. Neyman. Відмінності визначали статистично вірогідними при р < 0,05. Для перевірки вірогідності відмінностей між групами використовувався χ² та точний критерій Фішера.

Результати та обговорення

Розподіл випадків згідно з наявністю у них тих чи інших поліморфних генотипів та алелей rs35934224 гена TXNRD2 у групах хворих та статистична значущість розбіжностей наведені у табл. 1.

Розподіл генотипів у контрольній групі, згідно з отриманими у нашому дослідженні даними, був порівнянний з даними, наведеними у Програмі 1000 Genomes Project Phase 3 (http://www.internationa lgenome.org/). У Програмі для визначення частот генотипів rs35934224 гена TXNRD2 було залучено 2504 людини. Предковий генотип С/С був визначений з частотою 0,693 (у наших дослідженнях — 0,66), гетерозигота С/Т — 0,263 (у наших дослідженнях — 0,30), мутантна гомозигота Т/Т — 0,044 (у наших дослідженнях — 0,03); у європейський популяції (n = 503) показники становили 0,724; 0,245 і 0,032 відповідно.

Порівняння розподілу алелей у контрольній групі з даними Програми 1000 Genomes Project Phase 3 показало таке. Для всіх спостережень предкова алель С була визначена з частотою 0,824 (у наших дослідженнях — 0,81), мутантна алель Т — 0,176 (у наших дослідженнях — 0,19); для європейський популяції показники становили 0,846 та 0,154 відповідно. Отже, дані, отримані у контрольній групі, цілком відповідали даним Програми 1000 Genomes Project Phase 3.

Порівняно з контролем у групах хворих відмічена тенденція до зменшення частоти предкового гомозиготного генотипу С/С та збільшення частоти мінорного генотипу Т/Т (р = 0,012).

Найбільшого ступеня вираженості ця тенденція добігала у 3-й групі, де частота генотипу С/С була найменшою (0,44 проти 0,66 у контролі), а частота генотипу Т/Т — найбільшою (0,13 проти 0,03 у контролі).

Дискримінантний аналіз виявив вагомий внесок генетичного поліморфізму rs35934224 у розподіл хворих по групах (F = 4,21; p = 0,002), тобто, дійсно, той чи інший генотип визначав розподіл пацієнтів на групи.

Результати дисперсійного аналізу також підтвердили статистичну значущість впливу генотипу rs35934224 на груповий показник (F = 6,83; p = 0,001).

Відповідно до даних щодо розподілу генотипів, розподіл алелей показав, що у групах хворих відмічена тенденція до зменшення частоти предкової алелі С та збільшення частоти мінорної алелі Т (р = 0,001). Найбільшого ступеня ця тенденція також добігала у 3-й групі, де частота предкової алелі С була найменшою (0,65 проти 0,81 у контролі), а частота мінорної алелі Т — найбільшою (0,35 проти 0,19 у контролі).

Оцінка статистичної значущості розбіжностей розподілу генотипів та алелей між групами за критерієм χ² Пірсона наведена у табл. 2.

Результати аналізу показали значущість відмінностей контрольної групи від хворих на ПВКГ за розподілом як генотипів (χ² = 7,59; р = 0,022), так і алелей (χ² = 6,55; р = 0,01). При порівнянні груп з контролем статистичну значущість мали розбіжності за розподілом генотипів та алелей 3-ї (χ² = 12,35; р = 0,002 і χ² = 12,42; р = 4,2Е-4 відповідно) та 4-ї (χ² = 7,16; р = 0,028 і χ² = 5,52; р = 0,019 відповідно) груп.

Таким чином, можна було стверджувати, що розподіл поліморфних генотипів rs35934224 мав зв’язок з розвитком ПВКГ та впливав на її прогресування по стадіях патологічного процесу. При стратифікації хворих за ступенем периметричних змін було з’ясовано, що значущість різниць частот генотипів і алелей хворих певної групи порівняно з контролем зберігалася тільки для вираженої ПВКГ — у хворих з III і IV ступенем.

При порівнянні груп між собою було з’ясовано, що статистична значущість розподілу була наявною тільки для 1-ї і 3-ї груп (генотипів — χ² = 7,30; р = 0,026; алелей — χ² = 7,68; р = 0,005). Також за алелями була виявлена статистично значуща відмінність між 1-ю і 4-ю групами (χ² = 5,47; р = 0,019) та 2-ю і 3-ю групами (χ² = 4,49; р = 0,034), що загалом відображало загальні закономірності розподілу генотипів та алелей та вплив rs35934224 на прогресування захворювання.

Враховуючі отримані результати, надалі більш детально було проаналізовано відмінності між частотами генотипів і алелей rs35934224 контрольної групи і хворих на ПВКГ.

Розподіл предкової гомозиготи С/С та гетерозиготи С/Т в контрольній групі та у хворих на ПВКГ статистично не відрізнявся (р = 0,098 і р = 0,376 відповідно). На відміну від цього частота мінорної гомозиготи Т/Т у хворих з ПВКГ була у 3,3 раза вищою, що було статистично значущим (р = 0,008).

Відповідно до виявленого перерозподілу генотипів був відмічений вірогідний зсув частоти алелей у бік мінорної алелі Т. Частота предкової алелі С у хворих з ПВКГ була у 1,1 раза нижче (р = 0,013), тоді як частота мінорної алелі Т — у 1,4 раза вище, ніж у контролі (р = 0,013).

Надалі був розрахований вплив поліморфізму rs35934224 на ПВКГ (табл. 3).

Аналіз результатів щодо впливу генотипів, наведений у таблиці спряженості (3 × 3), показав, що поліморфізм rs35934224 мав зв’язок з захворюванням (χ² = 7,59; p = 0,022). Мінорна гомозигота Т/Т збільшувала у 3,3 раза шанси розвитку ПВКГ (ВШ 3,28; 95% ДІ 1,28–8,42), тоді як предкова гомозигота С/С такі шанси зменшувала у 1,5 раза (ВШ 0,68; 95% ДІ 0,45–1,04). Порівняння частот алелей, що наведено у таблиці спряженості (2 × 2), показало, що χ² = 6,55; p = 0,01. Мінорна алель Т збільшувала у 1,6 раза шанси розвитку ПВКГ (ВШ 1,58; 95% ДІ 1,11–2,25), тоді як предкова алель С такі шанси зменшувала у 1,6 раза (ВШ 0,63; 95% ДІ 0,44–0,90).

Таким чином, оскільки мінорна гомозигота Т/Т і алель Т збільшували шанси розвитку ПВКГ, то їх наявність можна було розглядати як фактор ризику розвитку ПВКГ. Шанси розвитку ПВКГ у хворих української популяції у носіїв генотипу Т/Т збільшені у 3,3 раза, у носіїв алелі Т — у 1,6 раза. При цьому за наявності предкової гомозиготи С/С та алелі С такий ризик був зниженим, що вказувало на їх протекторну дію.

Вплив поліморфізму rs35934224 на ПВКГ (табл. 4) у хворих 3-ї групи реалізувався більшою мірою порівняно з усіма хворими (для порівняння див. табл. 3).

У хворих 3-ї групи поліморфізм rs35934224 мав зв’язок з захворюванням (p = 0,002). Мінорна гомозигота Т/Т та алель Т збільшували шанси розвитку ПВКГ, тоді як предкова гомозигота С/С та алель С такі шанси зменшували. Такі результати, по-перше, підтвердили загальну закономірність зв’язку rs35934224 з ПВКГ, а по-друге, висвітлили іншу закономірність. Сила асоціативного зв’язку поліморфізму rs35934224 із збільшенням ступеня периметричних змін та переходом у ІІІ ступінь збільшувалася, що вказувало, на наш погляд, на асоціацію цього поліморфізму не тільки з виникненням, а й з прогресуванням ПВКГ.

При оцінці результатів у 4-й групі можна було очікувати кількісно більший зсув, ніж у 3-й групі. Але отримані результати показали майже те ж саме. Принципово цього можна було й очікувати, оскільки вірогідних відмінностей у цих групах за даними табл. 1 і 2 відмічено не було. З іншого боку, треба було врахувати й відсутність статистичних відмінностей щодо розподілу генотипів і алелей між 1-ю і 2-ю групами.

У зв’язку з цим можна було висунути припущення про те, що патогенетичний вплив поліморфізму rs35934224 проявлявся саме при переході ПВКГ з ІІ стадії у ІІІ. Дійсно, істотних розбіжностей частот генотипів і алелей поліморфізму rs35934224 при порівнянні контролю з хворими на ПВКГ з І стадією не існувало (табл. 1, 2). З іншого боку, не виявлено вірогідної різниці й між хворими з ІІІ і IV стадіями.

Отже, це давало підґрунтя припустити, що роль поліморфізму rs35934224 для прогресування ПВКГ реалізувалася саме на етапі переходу ПВКГ у ІІІ стадію. На наш погляд, це могло бути пов’язане з формуванням й прогресуванням саме на цій стадії патологічної екскавації диску зорового нерву, що відображає необоротне зменшення кількості нервових волокон, кровоносних судин та гліальних клітин [9].

Таким чином, ці результати переконливо підтвердили висловлене вище припущення. Доведено, що поліморфізм rs35934224 мав відмінності у розподілі генотипів і алелей між хворими на ПВКГ і контрольною групою. Причому зсув алелей і генотипів у бік мінорних наростав із збільшенням тяжкості патологічного процесу. Але стратифікація за стадіями периметричних змін при ПВКГ показала, що асоціація з захворюванням була значущою на ІІІ і IV стадіях. Більш того, шанси розвитку ІІІ стадії ПВКГ були суттєво вищими порівняно з І стадією у носіїв генотипів С/Т і Т/Т та алелі Т. У цьому ж плані посилювалася і протекторна дія предкового генотипу С/С.

Висновки

1. Доведено, що у хворих на ПВКГ української популяції розподіл генотипів rs35934224 (χ² = 7,59; р = 0,022) і алелей (χ² = 6,55; р = 0,01) був пов’язаний із розвитком захворювання. Гомозигота Т/Т збільшувала у 3,3 раза шанси розвитку ПВКГ (ВШ 3,28; 95% ДІ 1,28–8,42), а алель Т — у 1,6 раза (ВШ 1,58; 95% ДІ 1,11–2,25).

2. При стратифікації ПВКГ за ступенем периметричних змін було з’ясовано, що значущість різниць частоти генотипів та алелей хворих з контролем зберігалася для ПВКГ III та IV ступенів. Значущість відмінностей між 1-ю і 4-ю групами (χ² = 5,47; р = 0,019) та 2-ю і 3-ю групами (χ² = 4,49; р = 0,034) вказувала на асоціацію цього поліморфізму з прогресуванням ПВКГ, особливо на етапі переходу до ІІІ стадії.

Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів при підготовці даної статті.