Архив офтальмологии Украины Том 6, №3, 2018

Вступ

Більшість існуючих методів дослідження діабетичної макулопатії (ДМП) та діабетичного макулярного набряку (ДМН) заснована на наявності морфологічних змін на очному дні [1]. Звичайно, краще виявляти зміни на ранніх біохімічних і фізіологічних етапах розвитку патології сітківки, що дозволило б відповідні індикатори використовувати для прогнозування ризику ДМН. У цьому контексті перспективним є дослідження проагрегантного стану тромбоцитів (Тц), який може ініціювати тромбози і геморагії судин сітківки, ішемію нейросенсорних клітин і глії, розвиток запалення і акумуляцію інтерстиціальної рідини [2].

Це, на нашу думку та засновуючись на даних літератури, обґрунтовано тим, що, по-перше, Тц мають рецептори до різних агоністів, що викликає зростання їх функціональної активності під впливом патогенетичних чинників цукрового діабету (ЦД), зокрема при активації ренін-ангіотензинової та симпатоадреналової систем (АТ₁-рецептори і α₂-адренорецептори), розвитку запалення і ремоделювання міжклітинного матриксу (рецептори до фактора активації Тц — ФАТ і GPVI-рецептори до колагену). Ключовими патогенетичними механізмами ДМН є: а) зростання проникності капілярів гематоретинального бар’єру (ГРБ) для білків плазми, що призводить до зростання інтерстиціального осмотичного тиску (онкотичний механізм); б) артеріальна гіпертензія, що провокує підвищення капілярного гідростатичного тиску (гідростатичний механізм) [3, 4]. По-друге, Тц безпосередньо впливають на морфофункціональний стан ендотелію капілярів: нещодавні дослідження C. Deppermann (2018) продемонстрували, що при запаленні Тц беруть участь у підтримці цілісності ГРБ завдяки експресії GPVI-рецепторів до колагену, CLEC-2, інтегрину αIIbβ3 (GPIIb/IIIa), а також секреції біологічно активних речовин із α- та щільних гранул [5]. Однією із таких молекул може бути аденозиндифосфат (АДФ). Доведено, що ендотелій судин експресує пуринові рецептори P2Y₁₂; якщо заблокувати ці рецептори, то ендотеліальні клітини знижують експресію прозапальних молекул адгезії VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1) та міграцію макрофагів у сітківку. Таким чином, регулюється ще один механізм утворення ДМН — підвищення проникності судинної стінки [6]. По-третє, активовані Тц формують тромбоцитарно-лейкоцитарні агрегати в циркулюючій крові, що забезпечує адгезію лейкоцитів до ендотелію, також призводить до зростання проникності судинної стінки [7]. Крім того, Тц можуть регулювати патологічний ангіогенез завдяки формуванню проангіогенного фенотипу Тц, який характеризується зростанням продукції і секреції про- та антиангіогенних чинників [8]. Встановлено, що α-гранули містять широкий спектр білків, які регулюють ангіогенез (VEGF, ендостатин, ангіостатин та ін.) [9].

Таким чином, можна сподіватися, що аналіз функціональної активності Тц при діабетичній ретинопатії (ДР) дозволить сформувати уявлення стосовно чинників, що можуть провокувати проагрегантний статус Тц та викликати порушення мікроциркуляції в оболонках ока і розвиток ДМП і ДМН. Для успішного рішення проблеми необхідно відповісти на ряд питань: чи розвиток ДМН обумовлений такими ж патогенетичними чинниками ЦД, які беруть участь в прогресуванні ДМП при непроліферативній ДР; реактивність Тц до якого з агоністів більшою мірою відображає їх участь в розвитку ДМН?

У літературі є повідомлення про вплив функціонального стану тромбоцитів на порушення мікроциркуляції сітківки хворих на ЦД 2-го типу [19].

Раніше нами також були опубліковані дані щодо функціонального стану Тц у хворих на ЦД 2-го типу і непроліферативною ДР [18, 20].

Мета дослідження: проаналізувати порушення агрегації Тц при ДМН та ДМП за умов непроліферативної діабетичної ретинопатії (НПДР) при ЦД 2-го типу.

Матеріали та методи

Дослідження носило проспективний характер і включало 32 хворих (32 ока) із ЦД 2-го типу, у яких за результатами клініко-інструментального обстеження та відповідно до класифікації ETDRS виявлена легка (14 хворих, 14 очей) і помірна (18 хворих, 18 очей) стадії непроліферативної ДР.

Усім хворим були виконані загальноприйняті офтальмологічні дослідження, що включали візометрію, статичну периметрію Humphrey, рефрактометрію, тонометрію, біомікроскопію, гоніоскопію, офтальмоскопію за допомогою асферичної лінзи Volk Super/Field (NC USA) і контактної трьохдзеркальної лінзи Гольдмана. Всім хворим виконували спектрально-доменну оптичну когерентну томографію (ОСТ) на приладі Optopoltechnology, SOCT, Copernicus REVO (протокол Retina3D, RetinaRaster) і ОСТ в режимі «Ангіо» (протокол RetinaAngio, wide 6 x 6 mm). Також виконували дослідження очного дна на фундус-камері з його фотографуванням в 7 стандартних полях відповідно до модифікованої ETDRS системою клінічних ознак AirlieHouse. Флуоресцентну ангіографію (ФАГ) виконували за показаннями (у разі підозри на приховану неоваскуляризацію, яка не була ідентифікована офтальмоскопічно, і по фотографіях очного дна, а також у разі невідповідності зорових функцій офтальмоскопічним змінам в макулярній області або за даними ОСТ).

Рівень тяжкості ДР встановлювали відповідно до Міжнародної клінічної шкали тяжкості діабетичної ретинопатії Американської академії офтальмології (2002 р.). Рівень тяжкості ДМП встановлювали відповідно до Міжнародної клінічної шкали тяжкості діабетичної макулопатії Американської академії офтальмології (2002 р.).

ДМП встановлювали при наявності специфічних діабетичних змін сітківки в макулярній області: мікроаневризм, геморагій, інтраретинальних мікросудинних аномалій, вітреоретинальної судинної проліферації. Наявність ішемічної форми ДМП встановлювали при розширенні судинної аваскулярної зони і/або наявності зон капілярної оклюзії в макулярній області за даними ангіо-OCT і/або ФАГ. ДМН встановлювали при збільшенні товщини сітківки більше значень нормативної бази даних по полях ETDRS програмного забезпечення спектрально-доменної ОCT (зазначалося колірною шкалою, що підтверджувало збільшення товщини сітківки за межі норми — жовтим «p < 0,05» або червоним «p < 0,01» кольором). Збільшення товщини сітківки відзначали як без порушення архітектоніки, так і з її порушенням (кістозні порожнини в нейроепітелії, відшарування нейроепітелію, гіперрефлективні включення на рівні нейроепітелію, відповідні твердому ексудату, порушення архітектоніки внутрішніх шарів сітківки, відповідні інтраретинальним крововиливам або ватному ексудату). Пацієнтів із ДМП при помірній непроліферативній ДР також було розбито на дві підгрупи: підгрупа А — з діагностованим ДМН (n = 10) та підгрупа Б (n = 8) — без ДМН. У хворих з ДМП та легкою стадією непроліферативної ДР ДМН визначений не був у жодному випадку.

Дослідження агрегації Тц (АТц) проводили на базі Науково-дослідного інституту експериментальної та клінічної медицини Національного медичного університету імені О.О. Богомольця. Тц виділяли шляхом центрифугування із цитратної периферичної крові пацієнтів і використовували для оцінки функціональної активності рецепторів. В дослідженні застосовували агоністи, що залучені у патогенез ЦД, зокрема: АДФ, який забезпечує автокринну стимуляцію Тц, накопичується в щільних гранулах і підтримує проагрегантний статус Тц; адреналін — гуморальний фактор, рівень якого зростає за умов стрес-реакції внаслідок активації симпатоадреналової системи; ангіотензин-2 (Анг-2) — гуморальний фактор, рівень якого зростає внаслідок активації ренін-ангіотензинової системи; ФАТ — паракринний медіатор, що забезпечує стимуляцію Тц, а також взаємодію лейкоцитів і Тц у реалізації запалення; колаген — системний чинник, що відбиває вплив концентрації розчиненого колагену в крові та/або експресії колагену міжклітинного матриксу на тромбоцитарну ланку гемостазу.

Агоністи (Sigma, США) використовували в ефективній концентрації (ЕС₅₀), яка викликала АТц на рівні 50 ± 5 %. Для адреналіну вона становила 2,5 ± 0,1 мкМ, для колагену — 1,00 ± 0,03 мг/мл, для Анг-2 — 1,00 ± 0,06 мкМ, для ФАТ — 75,0 ± 2,6 мкМ і для АДФ — 2,50 ± 0,05 мкМ. Оцінку агрегації Тц проводили турбодиметричним методом на аналізаторі Chronolog (США).

У всіх обстежених отримано інформовану згоду пацієнта на участь в дослідженні.

При проведенні аналізу використовували статистичний пакет Medcalc. Точкова оцінка величин, що підлягали аналізу, проводилася шляхом розрахунку середнього арифметичного () та відповідної стандартної похибки (m) або медіани (Me; Q_I; Q_III). При аналізі міжгрупових розбіжностей застосовували критерій Стьюдента (у випадку нормального закону розподілу та кількісних характеристик), критерій Вілкоксона (у випадку відмінності закону розподілу від нормального та кількісних характеристик), метод кутового перетворення Фішера (у випадку порівняння частоти якісних ознак). У всіх випадках відмінність вважалася статистично значущою при рівні значущості р < 0,05.

Результати та обговорення

У пацієнтів з ДМП за умов помірної непроліферативні ДР мала місце гіперреактивність Тц стосовно чотирьох агоністів: колагену, адреналіну, Анг-2 і ФАТ (табл. 1). Причому порівняно з ДМП при легкій стадії непроліферативної ДР виявлена більша реактивність Тц до Анг-2 (на 21,2 %; р < 0,001), ФАТ (на 19,0 %; р < 0,001) і адреналіну (на 9,1 %; р < 0,05). Реакція Тц на колаген відповідала діапазону гіперреактивності (57–74 %) і була порівнянною в обох підгрупах.

Необхідно підкреслити, що при аналізі групової реактивності Тц у пацієнтів з ДМП при помірній стадії непроліферативної ДР провідним фактором індукції АТц був адреналін, стосовно якого ефект Анг-2 був меншим на 8,3 %, ФАТ — на 10,5 %, колагену — на 11,8 % і АДФ — на 32,1 % (р < 0,01 для всіх порівнянь). Таким чином, у хворих з ДМП при помірній непроліферативній ДР мав місце гіперадренореактивний тромбогенний фенотип. В даному фенотипі реакція Тц на колаген і ФАТ була на 14,7 і 13,3 % відповідно менше, ніж на Анг-2 (р < 0,001); а реакція Тц на АДФ була на 14,5 % менше, ніж така на ФАТ (р < 0,001).

Показано, що у хворих з ДМП при легкій та помірній стадіях непроліферативної ДР виявлена загальна риса — гіперреактивність Тц на колаген на тлі нормореактивності до АДФ; а отже, ремоделювання міжклітинного матриксу сполучної тканини є неспецифічним механізмом на ранніх стадіях ДМП при розвитку ДР. Реакція Тц на колаген може бути інформативним індикатором їх функціонального стану при ДМП. До особливостей реактивності Тц хворих з ДМП при помірній стадії непроліферативної ДР можна було віднести зростаючий вплив адреналіну, Анг-2 і ФАТ (р < 0,01). Даний феномен відбивав підвищення стимуляції α2-адрено-, АТ1- і ФАТ-рецепторів Тц при прогресуванні порушень в симпатоадреналовій і ренін-ангіотензиновій системах та зростанні тяжкості запалення. За цих умов відтворювався новий якісний рівень гіперреактивності Тц, наслідком чого може бути зміна спектра секретованих речовин, що забезпечувало зростання морфологічних змін на очному дні (збільшення кількості мікроаневризм і мікрогеморагій, появу ватного ексудату, інтраретинальних мікросудинних аномалій і сегментарного розширення вен сітківки).

Таким чином, вираженість активації регуляторних систем і запальної реакції можуть розглядатися як фактори ризику прогресування ДМП при переході від легкої до помірної стадії непроліферативної ДР, а функціональна активність α2-адренорецепторів, АТ1-рецепторів і ФАТ-рецепторів Тц може бути інформативним індикатором для прогнозування ризику прогресування ДМП.

До теперішнього часу невідомо, чи відрізняється функціональна активність Тц при ДМП за умов розвитку ДМН. Чому при тій же самій стадії ДМП у одних хворих виникає ДМН, а у других він відсутній? Відповідь на ці питання необхідна у зв’язку з пошуком інформативних індикаторів для прогнозування ризику розвитку ДМН. В даному контексті мало сенс перерозподілити пацієнтів із ДМП при помірній стадії непроліферативної ДР на дві підгрупи: підгрупу А — 10 (55,6 %) хворих, у яких був виявлений ДМН (товщина сітківки в центральній зоні > 300 мкм), та підгрупу Б — 8 (44,4 %) хворих, у яких ДМН діагностовано не було. Порівняння функціональної активності Тц в межах однієї стадії з наявністю ДМН і без ДМН дозволило відповісти на ключове питання: які фактори патогенезу ДМП при помірній непроліферативній ДР впливали на розвиток ДМН, тобто були специфічними для зростання проникності ГРБ і акумуляції інтерстиціальної рідини в макулі сітківки?

Проведене дослідження показало, що в підгрупі А зберігалася гіперреактивність Тц стосовно чотирьох агоністів: адреналіну, Анг-2, ФАТ і колагену (табл. 2).

Аналіз адренореактивності Тц свідчив, що у цих пацієнтів мала місце гіперреактивність α₂-адренорецепторів. Реакція Тц на адреналін перевищувала таку на Анг-2 на 5,8 % (р = 0,007), ФАТ — на 21,9 % (р < 0,001), колагену — на 33,7 % (р < 0,001), АДФ — на 42,9 % (р < 0,001). Таким чином, кластер активності рецепторів мав наступний вигляд: активність α₂-адренорецептора > АТ₁-рецептора > ФАТ-рецептора > GPVI-рецептора > пуринових рецепторів.

У хворих підгрупи Б також виявлена гіперреактивність α₂-адренорецепторів. Реакція Тц на адреналін перевищувала таку на колаген на 3,8 % (р = 0,022), Анг-2 — на 13,3 % (р < 0,001), ФАТ — на 29,3 % (р < 0,001), колагену — на 33,7 % (р < 0,001), АДФ — на 47,4 % (р < 0,001). Отже, кластер активності рецепторів Тц в підгрупі Б мав інший вигляд: активність α₂-адренорецептора > GPVI-рецептора > АТ₁-рецептора > ФАТ-рецептора > пуринових рецепторів.

У хворих з ДМП при помірній стадії непроліферативної ДР при наявності чи відсутності ДМН відрізнялася реакція Тц на колаген і Анг-2: при наявності ДМН реакція Тц на Анг-2 перевищувала таку в підгрупі пацієнтів без ДМН на 5,1 % (р < 0,05), тоді як при відсутності ДМН реактивність Тц до колагену перевищувала таку на 31,3 % (р < 0,001) стосовно підгрупи хворих без ДМН. Реакція Тц до адреналіну, ФАТ і АДФ статистично значуще не відрізнялася (р > 0,05).

Таким чином, у пацієнтів з ДМП при помірній стадії непроліферативної ДР був представлений гіперадренореактивний фенотип Тц, який характеризувався двома кластерами функціонального стану рецепторів, що відбивало різний ступінь індукуючого впливу Анг-2 і колагену на Тц залежно від наявності ДМН. Причому ефекти цих патогенетичних факторів полярні: при наявності ДМН реєструвалася більш виражена реакція Тц на Анг-2, що відбивало суттєве зростання активності ренін-ангіотензинової системи (внаслідок чого підвищувалася сенситивність АТ₁-рецепторів Тц), тоді як стан міжклітинного матриксу сітківки лишався стабільним (нормореактивність GPVI-рецепторів чи їх невелика гіперреактивність у частини хворих).

Протилежний ефект демонстрував кластер при відсутності ДМН — зростала реакція Тц на колаген (підвищувалася сенситивність GPVI-рецепторів Тц), тоді як активність ренін-ангіотензинової системи зменшувалася (знижувалася гіперреактивність АТ₁-рецепторів Тц). Отже, з трьох встановлених факторів ризику прогресування ДМП при непроліферативній ДР (активація симпатоадреналової, ренін-ангіотензинової систем і запалення) саме гіперреактивність Тц до Анг-2 могла бути причиною розвитку ДМН.

Механізми цього ефекту можуть бути різними. Підвищення рівня Анг-2 через стимуляцію AT₁-рецепторів призводить до зростання експресії VEGF, який пошкоджує ГРБ [10], та накопичення міжклітинного матриксу, що призводить до розвитку фіброзу [11]. Причому гіперглікемія стимулює експресію гена ангіотензиногену через шлях обміну гексозаміну і, таким чином, збільшує синтез Анг-2 [12]. Блокада AT₁-рецепторів на ендотеліальних клітинах і перицитах судин забезпечує цитопротекторні ефекти. Експериментальне дослідження [13] показало, що інгібування ренін-ангіотензинової системи послаблювало підвищену судинну проникність сітківки при ЦД, що супроводжувалося відновленням тісних зв’язків міжклітинних білків в стінці судин. Результати останніх клінічних випробувань [14] свідчили про роль блокаторів ренін-ангіотензинової системи (інгібіторів АПФ і блокаторів рецепторів Анг-2) та фенофібрату в зниженні прогресії та/або індукції регресії від помірної до легкої стадії непроліферативної ДР.

Інгібітори АПФ ефективні для затримки прогресування ДР, але невідомо, чи є виправданим їх використання у хворих з ДМН. Зокрема, [15] не виявили ніякого сприятливого ефекту інгібітору АПФ у хворих із діабетичною макулярної ішемією. Нові сподівання надали дослідження [16], які були проведені на трансгенних щурах dTGR, в сітківці яких мала місце підвищена експресія ангіотензиногену та реніну. За цих умов виявлялась дегенерація гангліозних клітин сітківки.

V.M. Milenkovic et al. (2010) [17] встановили, що системне введення інгібітору АПФ підвищувало експресію реніну в пігментних клітинах сітківки. Даний факт підтвердив гіпотезу, що локальна експресія реніну в клітинах ГРБ знаходиться під контролем ренін-ангіотензинової системи організму. У світлі наведених фактів і отриманих у даному дослідженні результатів інгібітори АПФ можуть мати терапевтичний потенціал при лікуванні ДМП і ДМН.

Висновки

1. Патогенетичні чинники ЦД можуть провокувати проагрегантний статус Тц та тим самим викликати порушення мікроциркуляції в оболонках ока, що супроводжується розвитком ДМП і ДМН при непроліферативній ДР. Аналіз функціональної активності Тц дозволив оцінити вплив патогенетичних факторів ЦД на прогресування ДМП і розвиток ДМН.

2. У хворих з ДМП при легкій і помірній стадіях непроліферативної ДР виявлена загальна риса — гіперреактивність Тц на колаген, а отже, ремоделювання міжклітинного матриксу сполучної тканини є неспецифічним механізмом розвитку ДМП на ранніх стадіях. До особливостей реактивності Тц хворих із ДМП при помірній стадії непроліферативної ДР відносився зростаючий вплив адреналіну, Анг-2 і ФАТ, що відбивало прогресування порушень в симпатоадреналовій і ренін-ангіотензиновій системах, та вираженість запалення, наслідком чого був новий функціональний стан Тц (кластер), який обумовлював відповідні морфологічні зміни на очному дні.

3. Вираженість активації симпатоадреналової і ренін-ангіотензинової системи та запальної реакції можуть розглядатися як чинники ризику прогресування ДМП при непроліферативній ДР, а функціональна активність α₂-адренорецепторів, АТ₁-рецепторів і ФАТ-рецепторів Тц можуть бути інформативними індикаторами прогнозування ДМП. Гіперреактивність Тц до Анг-2 могла бути причиною розвитку ДМН.

Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів при підготовці даної статті.