Архив офтальмологии Украины Том 7, №3, 2019

Вступ

Вікова макулярна дегенерація (ВМД) залишається однією з актуальних медико-соціальних проблем з огляду на її поширеність, зниження зорових функцій і, як наслідок, слабозорість та сліпоту [1]. На підставі аналізу сучасної літератури можна зробити висновок, що встановлення нових прогностичних чинників розвитку ВМД є дуже актуальним завданням [2, 3]. Наступним кроком є розробка математичних моделей прогресування ВМД на підставі визначення демографічних і екологічних предикторів, офтальмологічних, зокрема макулярних, і генетичних показників [4, 5]. Перспективним вважається дослідження особливостей метаболізму клітин та виявлення біологічно активних речовин, які регулюють розвиток патологічного процесу у структурах ока [6, 7].

У цьому контексті вивчення рецепторного апарату тромбоцитів (Тц) уявляється перспективним, оскільки дозволяє аналізувати: а) функціональну активність Тц і своєчасно виявляти їх проагрегантний стан, наслідком чого є порушення мікроциркуляції і, відповідно, трофіки тканин сітківки; б) провідні патогенетичні чинники ВМД (фактори ризику), що впливають на перебіг захворювання і визначають розвиток ускладнень; в) можливість впливу Тц, які секретують біологічно активні речовини: аденозинтрифосфат (АТФ), аденозиндифосфат (АДФ), аденозин, іони кальцію, васкулоендотеліальний фактор (VEGF) на клітини сітківки з відповідними рецепторами, особливо при зростанні проникності гематоретинального бар’єра [8–10].

Щодо прогнозування ризику прогресування ВМД можливості цього методологічного підходу використані не повною мірою. Зокрема, немає даних стосовно активності рецепторів Тц та їх взаємодії при прогресуванні ВМД. Не з’ясовано, функціональний стан яких рецепторів відображує зміни сітківки ока при початкових проявах ВМД та при розвитку ексудативної форми захворювання.

Мета: дослідити можливості прогнозування прогресування вікової макулярної дегенерації на підставі визначення функціональної активності рецепторів тромбоцитів.

Матеріали та методи

Дослідження мало проспективний характер і включало 146 хворих (242 ока), у яких за результатами офтальмологічного обстеження та згідно з класифікацією AREDS [11] відзначалися: відсутність виявлення ВМД (1-ша категорія за AREDS) — 35 хворих (48 очей); рання стадія ВМД (2-га категорія) — 36 хворих (68 очей); проміжна стадія (3-тя категорія) — 38 хворих (59 очей) і пізня стадія (4-та категорія) — 37 хворих (67 очей). Офтальмологічне обстеження включало збір анамнезу, візометрію за допомогою комп’ютеризованого фороптера Refractor RT-5100, Nidek (Японія) та проектора оптичних знаків CP-770, Nidek (Японія), тонометрію на пневмотонометрі FT-1000, Tomey (Японія), кераторефрактометрію на авторефрактометрі RT-7000, Tomey (Японія), біомікроскопію на щілинній лампі Topcon IS-600 (Японія), офтальмоскопію за допомогою лінзи Digital Wide Field, Volk Optical (США), фотографування очного дна на фундус-камері Visucam 524, Carl Zeiss (Німеччина) та оптичну когерентну томографію на оптичному когерентному томографі REVO NX, Optopol (Польща). Флюоресцентну ангіографію виконували за показаннями у разі підозри на приховану неоваскуляризацію.

Тромбоцити виділяли шляхом центрифугування цитратної периферичної крові пацієнтів і використовували для оцінки функціональної активності рецепторів. У дослідженні застосовували агоністи рецепторів, залучені в патогенез ВМД, зокрема: АТФ, АДФ і аденозин (відповідно, ліганди пуринових Р2Х-, Р2Y-, та А2А-рецепторів); фактор активації тромбоцитів (ФАТ), адреналін та ізадрин (відповідно, ліганди α₂- і β₂-адренорецепторів). Активність аденозинових А2А-рецепторів і β₂-адренорецепторів досліджували при сумісній інкубації АДФ з аденозином або АДФ з ізадрином і розраховували як різницю агрегації Тц (АТц), індукованої АДФ, і остаточної АТц, зареєстрованої при спільній інкубації АДФ з аденозином або АДФ з ізадрином. Агоністи (Sigma, США) використовували в ефективній концентрації (ЕС₅₀), що не викликала у 10 здорових волонтерів змін на очному дні (контрольна група), АТц на рівні 50 ± 5 %. Оцінку АТц проводили турбидиметричним методом на аналізаторі Chrono-Log (США). В усіх обстежених отримано інформовану згоду на участь у дослідженні.

Для аналізу зв’язку стадії ВМД із значенням показників окремих агоністів було використано методи парного кореляційного аналізу (розраховувався показник рангової кореляції Спірмена) та побудови моделей багатофакторної лінійної регресії (узагальнені регресійні моделі). Адекватність моделі оцінювали за скоригованим показником детермінації (R²_adjusted). Для оцінки ступеня впливу кожної з факторних ознак у багатофакторній моделі були розраховані частинні коефіцієнти кореляції (r_част.). Cтатистичний аналіз проводився з використанням пакета EZR v.1.35 (Saitama Medical Center, Jichi Medical University, Saitama, Японія), що являє собою графічний інтерфейс до R (The R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Австрія).

Результати та обговорення

При проведенні аналізу було виявлено зв’язок кожної стадії ВМД із значенням показників функціональної активності рецепторів тромбоцитів. Виявлено сильний позитивний кореляційний зв’язок показників АТц, індукованої АТФ та аденозином, зі стадією ВМД (ρ = 0,9 та ρ = 0,878 відповідно; p < 0,05). Середньої сили позитивний зв’язок встановлено між стадією та активністю Р2Y- і ФАТ-рецепторів, а також тривалістю захворювання (r = 0,664 i r = 0,516 відповідно; р < 0,05).

Несподіваним результатом можна вважати залежність стадії захворювання від стану Р2Х-рецепторів Тц, а не Р2Y- і ФАТ-рецепторів. Останні вважаються ключовими регуляторами зростання проагрегантного стану Тц, а отже наявність помірного чи слабкого зв’язку стадії з АТц, індукованою АДФ і ФАТ, свідчить: а) про ризик порушення мікроциркуляції ока; б) наявність особливостей взаємодії рецепторів при кожній стадії ВМД. За цих умов логічно, що аденозин, який забезпечує не тільки антиагрегантну, але й протизапальну дію, є ключовим фактором прогресування ВМД. Тривалість захворювання позитивно корелює зі стадією ВМД (тобто детермінує прогресування ВМД) та функціональним станом досліджених рецепторів: пуринових (Р2Х-, Р2Y- і А2А-), ФАТ- і α₂-адренорецепторів (табл. 1). Якщо порівняти силу кореляційного зв’язку Р2Х-рецепторів, то вона зменшувалася в такому порядку: активність А2А-рецепторів > Р2Y-рецепторів > ФАТ-рецепторів і α₂-адренорецепторів. Отже, реактивність Р2Х-рецепторів сильно модулюється локальними паракринними механізмами за участю аденозинової системи (гальмується) і АДФ (підсилюється).

Стимуляція Р2Y-рецепторів може підсилюватися Р2Х-рецепторами, ФАТ-рецепторами і α₂-адренорецепторами та обмежуватися А2А-рецептором і β₂-адренорецептором. Отже, секреція БАР з активованих Тц, запалення й активація САС можуть потенціювати ефект стимуляції Р2Y-рецепторів, а система «цАМФ — протеїнкіназа А» знижує відтворений ефект АДФ. Стимуляція Р2Y-рецепторів виявляє середньої сили зв’язок із стадією та слабку кореляцію з давністю ВМД.

Отже, запалення (яке опосередковано секрецією лейкоцитами ФАТ) і позаклітинний метаболізм пуринів (АТФ, АДФ, АМФ, аденозину) при розвитку гіпоксії та/або ішемії тканин можуть більшою мірою впливати на реактивність Р2Y-рецепторів, ніж катехоламіни.

Стимуляція ФАТ-рецепторів (зокрема на Тц) помірно залежить від функціонального стану Р2Y-рецептора, слабкою мірою — від активності Р2Х- і А2А-рецепторів та в незначному ступені — від ізадрину. Отже, вплив медіатора запалення (ФАТ) може суттєво зростати за умов гіперреактивності Р2Y-рецептора. Метаболізім пуринів і рівень катехоламінів суттєво не впливають на розвиток запалення при ВМД.

Кореляційний аналіз також свідчить, що результат активації α₂-адренорецептора слабкою мірою залежить від активації Р2Х-рецептора, аденозинового А2А-рецептора та незначною мірою — від АДФ. В основі встановлених взаємовідносин рецепторів лежать механізми, що забезпечують модуляцію рівня внутрішньоклітинного Са²⁺.

Активація аденозинових А2А-рецепторів вважається канонічним механізмом обмеження тромбогенезу і запалення. В дослідженні встановлено зв’язок високої сили між станом А2А-рецепторів і Р2Х-рецепторів, помірної сили — з Р2Y-рецептором, слабкої сили — з ФАТ-рецептором і α₂-адренорецептором. Отже, вплив А2А-рецепторів на активацію інших рецепторів може бути такий: активність Р2Х-рецептора > активність Р2Y-рецептора > активність ФАТ-рецептора = α₂-адренорецептора. Поданий ланцюг взаємодіючих рецепторів об’єднує одна мета — підвищення рівня внутрішньоклітинного Са²⁺. У цьому контексті зростання активності А2А-рецепторів утворення цАМФ і активація протеїнкінази А може трактуватися як компенсаторний механізм у патогенезі ВМД. Стимуляція катехоламінами β₂-адренорецепторів незначною мірою може модулювати лише активність Р2Y-рецептора і ФАТ-рецептора.

Наведена складність взаємодії досліджених рецепторів при прогресуванні ВМД диктує необхідність моделювання цього процесу, що дозволило б прогнозувати стадії захворювання.

На першому етапі регресійного аналізу на двофакторних ознаках АТц, індукованої АТФ та аденозином (які були сильно пов’язані зі стадією ВМД), побудована лінійна модель регресії оцінки стадії цього захворювання (табл. 2).

Двофакторна модель виявилась адекватною, оскільки скорегований коефіцієнт детермінації R²_adj = 0,87 (значення критерію Фішера F = 158,0 при p < 0,001) свідчив про сильний зв’язок активності Р2Х- і А2А-рецепторів зі стадією ВМД.

Сам по собі факт побудови моделі прогнозування стадії ВМД на підставі значень активності двох показників є важливим з практичної точки зору, оскільки мінімізує час і фінансування, необхідні для проведення дослідження. Однак з теоретичної точки зору виникає питання: за наявності виявлених складних взаємин між функціонуючими рецепторами чи не збільшиться точність прогнозу, якщо залучити до аналізу інші досліджені фактори?

Для виділення набору ознак, сильно пов’язаних зі стадією ВМД (Y) в рамках множинної лінійної моделі регресії, було проаналізовано 9 факторних ознак: вік, тривалість захворювання, стать та значення АТц, індукованої АТФ, АДФ, аденозином, ФАТ, адреналіном та ізадрином. Для відбору значимих ознак використано метод покрокового відкидання/додавання (Stepwise, при критичному порозі виключення ознаки — p₁ > 0,1 і критичному порозі включення — p₂ < 0,05).

В результаті аналізу було виявлено п’ять значимих ознак: активність пуринових Р2Х-, А2А-рецепторів, ФАТ-рецепторів, а також α₂- і β₂-адренорецепторів. Лінійна модель, побудована на виділених ознаках, є адекватною, оскільки скорегований коефіцієнт детермінації R²_adj сягає 0,90 (значення критерію Фішера (F) = 260,6 при p < 0,001). Отже, в рамках даної моделі підтверджено сильний зв’язок активності цих рецепторів зі стадією ВМД (табл. 3).

Слід зазначити, що у багатофакторній лінійній моделі, як і при парній кореляції, виявлено виражений позитивний зв’язок функціональної активності Р2Х- та А2А-рецепторів із стадією ВМД (відповідно, r_част. = 0,69 та r_част. = 0,675 при p < 0,05). Водночас, при урахуванні впливу інших факторних ознак, виявлено позитивний кореляційний зв’язок стадії ВМД з активністю ФАТ-рецепторів і α₂-адренорецепторів, та негативний зв’язок з активністю β₂-адренорецепторів (r_част. = –0,257; p < 0,05), чого не було виявлено при проведенні парного кореляційного аналізу.

Наведені дані свідчать, що, з одного боку, активність пуринових рецепторів дійсно визначає прогресування захворювання; а з другого — на розвиток кожної стадії впливають запалення і гіперкатехолемія (оскільки ФАТ-рецептори, α₂- і β₂-адренорецептори модулюють активність Р2Х- і А2А-рецепторів).

На перший погляд, несподіваним може здатися відсутність у моделі прогресування ВМД показника активності Р2Y-рецепторів, які забезпечують зростання функціональної активності Тц внаслідок секреції із щільних гранул АДФ і АТФ, тим більше, що при парній кореляції виявлено кореляційні зв’язки між АТц, індукованою АДФ і різними агоністами. А втім, взаємодія Р2Y-рецепторів з іншими рецепторами при кожній стадії ВМД суттєво не впливала на прогресування ВМД. Крім того, активація Р2Y-рецепторів може нівелюватися ефектами АТФ, ФАТ, адреналіну, аденозину й ізадрину. Що стосується гіперреактивності Р2Y₁- і Р2Y₁₂-рецепторів, то в кожній стадії даний механізм підтримує стабільний проагрегантний стан Тц, що забезпечує порушення мікроциркуляції і трофіки сітківки ока.

Отримана п’ятифакторна лінійна модель зв’язку стадії вікової макулярної дегенерації (Y) з показниками функціональної активності Р2Х-рецептора (X1), А2А-рецептора (X2), ФАТ-рецептора (X3), α₂-адренорецептора (X4) і β₂-адренорецептора (X5) може бути виражена рівнянням:

Y = –4,05 + 0,053 • X1 + 0,030 • X2 + 0,016 • X3 + 0,019 • X4 – 0,013 • X5.   (1)

Проведений аналіз свідчить про можливість визначення стадії ВМД за показниками функціональної активності Р2Х-рецепторів, А2А-рецепторів, ФАТ-рецепторів, α₂- і β₂-адренорецепторів.

У табл. 4 наведена точність прогнозування стадії ВМД за значенням показника Y, розрахованого за рівнянням (1).

Є сенс порівняти точність прогнозування прогресії ВМД за даними провідних дослідницьких груп, які займаються створенням відповідних моделей. F Grassmann et al. [12] розробили автоматизований комп’ютерний алгоритм класифікації стадій ВМД, заснований на визначенні 13 класів патології сітківки (9 кроків AREDS для виявлення легкої і проміжної форм захворювання, 3 стадії пізньої ВМД і 1 стадія за відсутності проявів ВМД). Алгоритм виявив 84,2 % випадків з ознаками ранньої або пізньої ВМД. K. Shin et al. [13] провели аналіз системних та екологічних факторів ризику ВМД у даної популяції хворих для створення індивідуального алгоритму ризику прогресування ВМД. Індивідуальний алгоритм прогнозування ризику прогресування ВМД розрахований за таким рівнянням:

Y = –9,565 + 1,709 (центральна локалізація) ++ 0,795 (парацентральна локалізація друз) +1,074 (ураження обох очей) + 0,094 (розмірвеликих друз) + 0,614 (кількість друз 10–20) ++ 2,278 (кількість друз > 20) + 0,577(гіперпігментація) + 0,725 (гіпопігментація) ++ 0,079 (чоловіки) — 0,025 (вік) —– 0,921 (SMKex) + 1,574 (SMK) + 0,363(загальний білок плазми) + 1,626 (глобуліни крові),            (2)

де SMK означає статус куріння. Значимість критерію для моделі становила 0,84 (0,75–0,92), що вказує на добру прогностичну силу. Y. Peng et al. [14] розробили нейромережеву систему (DeepSeeNet) для класифікації патології сітківки пацієнтів автоматично за шкалою AREDS Simplified Severity Scale на підставі даних двобічної офтальмоскопії. DeepSeeNet краще (точність = 0,671) виконувала класифікацію пацієнтів, ніж офтальмологи (точність = 0,599). З високим значенням AUC (точність = 0,940) модель виявляла великі друзи та пігментні відхилення (точність = 0,930). Однак система показала більш низьку ефективність при виявленні пізньої стадії ВМД (точність = 0,967, у фахівців = 0,973).

Отже, точність прогнозування стадії ВМД на основі аналізу активності рецепторів Тц збігається з наведеними в літературі даними при створенні моделей, заснованих на аналізі морфологічних змін сітківки при ВМД і патогенетичних факторів ризику прогресування цієї патології. Однак дослідження Тц in vitro має низку переваг: а) визначаються конкретні патогенетичні фактори ВМД, і здійснюється індивідуальна оцінка ризику прогресування захворювання у хворого, без моделювання ситуації, заснованої на дослідженні когорти хворих; б) виключається вплив людського фактора на аналіз офтальмологічних даних, тобто виключається залежність від кваліфікації лікаря-офтальмолога, на що звертають увагу Y. Peng et al. [14]; в) забезпечується швидкість аналізу, реєстрація АТц індукованої займає 20–25 хвилин.

Таким чином, з урахуванням даних літератури стосовно точності прогнозу прогресування ВМД, розробка моделей, заснованих на аналізі функціональної активності рецепторів Тц, уявляється перспективною.

Висновки

1. Функціональна активність Р2Х-, А2А- і ФАТ-рецепторів, α₂- і β₂-адренорецепторів Тц є незалежним фактором ризику, асоційованим з високою ймовірністю прогресування ВМД.

2. Розроблена п’ятифакторна лінійна модель зв’язку стадії ВМД з показниками функціональної активності Р2Х-, А2А- і ФАТ-рецепторів, α₂- і β₂-адренорецепторів має високу точність прогнозу (85,6 %).

3. Виявлення осіб високого ризику прогресування ВМД на більш ранній стадії за допомогою запропонованих моделей розрахунку індивідуального розвитку захворювання може сприяти поліпшенню профілактичних і терапевтичних методів лікування.

Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів при підготовці даної статті.