Журнал «Внутренняя медицина» 1(1) 2007

Генная терапия (gene therapy) — это перспективная экспериментальная терапия, направленная на выключение дефектных генов или восстановление их нормальной функции при заболеваниях, на течение которых влияет элиминация или предоставление соответствующих генов / белков, а прочие методы лечения оказываютcя неэффективными.

Теоретически генная терапия может быть проведена в отношении и соматических, и половых клеток. При соматической генной терапии изменения, внесенные в геном пациента, не передаются потомству. Аналогичные воздействия на половые клетки с целью передачи генетической информации последующим поколениям в настоящее время не применяют, в т.ч. и по этическим соображениям.

Среди методов модификации генной функции чаще всего используют внесение (перенос) терапевтического гена. Разрабатываются методы коррекции дефектных генов (при мутациях, изменяющих небольшой участок ДНК), замены дефектных генов нормальными или блокады их экспрессии, методы усиления экспрессии нормальных генов и восстановления экспрессии блокированных генов. Перспективно и «наращивание» гена, при котором к нему добавляется часть, изменяющая функцию. Разрабатывается метод, при котором вектор будет содержать ген, кодирующий продукцию необходимого белка, а также молекулярную структуру, способную регулировать экспрессию гена в зависимости от приема внутрь специального лекарственного средства.

Различают непрямую (клеточную, ex vivo) и прямую (in vivo) генную терапию. При терапии ex vivo специфические типы клеток выделяют из организма и культивируют вне его, затем в них вводят чужеродные терапев­тические гены, отбирают трансформированные клеточные клоны и вводят их тому же человеку. Этот вид генной терапии используется для генетической трансформации эндотелиальных клеток и последующего покрытия ими венозных шунтов и внутрисосудистых стентов. Генная терапия in vivo основана на прямом введении терапевтических генов (с помощью векторных систем) в стенку сосуда, миокард или скелетные мышцы.

Для введения генов в клетки-мишени сосудов используют оба подхода, но значительно чаще применяют прямую методику. Кроме выбора потенциально терапевтических генов успех лечения зависит от характеристик специальных генных носителей (векторных систем / векторов) и от средств механической доставки векторов к клеткам-мишеням. В идеале векторы должны обеспечивать эффективное и безопасное проникновение и экспрессию терапевтических генов в клетках-мишенях, а средства механической доставки векторов к этим клеткам — легко и нетравматично помещать вектор в нужный участок сосуда, избегая попадания генетического материала в системный кровоток. Ограниченная емкость векторов усложняет доставку больших генов.

Векторные системы бывают вирусными и невирусными. Для клинического применения они должны обладать определенными качествами, и следует отметить, что универсальных векторов не существует. Выбор вектора и метода его доставки определяется конкретной задачей генной терапии (в какие клетки требуется ввести терапевтический ген, как долго требуется его экспрессия и в каком количестве и т.д.). Большинство доступных на сегодня векторов для терапии in vivo обеспечивает временную экспрессию перенесенных генов в клетке, поэтому и лучшие результаты генной терапии получены при заболеваниях и состояниях, не требующих пожизненной активности терапевтических генов (например, при рестенозах просвета артерий, развивающихся после баллонной ангиопластики, стентирования или атерэктомии).

Невирусные векторы представлены либо плазмидной ДНК, либо комплексами ДНК с липосомами, аденовирусными белками, трансферрином, полилизином и т.д. Плазмидная ДНК не встраивается в геном хозяина и обеспечивает лишь 2–4-недельную экспрессию гена. Кроме того, трансфекция клеток плазмидной ДНК in vivo составляет всего 0,1 %, и поэтому метод используют при необходимости некоторое время секретировать белок, способный по паракринному механизму действовать на другие клетки. Если же требуется длительная экспрессия белка, активного только в той клетке, где он синтезирован, используют модификации вектора. Так, для повышения трансфекции клеток сосудов in vivo до 4–5 % применяют липосомальный плазмидный вектор, при этом положительный заряд обволакивающих ДНК липидных пузырьков способствует проникновению ДНК через отрицательно заряженную мембрану клетки-мишени.

Вирусные векторы представлены ослабленными или модифицированными ретровирусами, аденовирусами, аденоассоциированными вирусами, вирусом герпеса 1-го типа, лентивирусами и т.д. Ретровирусные векторы применяются только для сосудистой генной терапии ex vivo, а неиспользование in vivo обусловлено их недостатками (табл. 1). Аденовирусные векторные системы в сотни и тысячи раз эффективнее, чем плазмидные и ретровирусные, но обеспечивают лишь кратковременную экспрессию введенных генов (до 4 недель), а повторные введения чреваты развитием воспалительных и иммунных реакций, особенно в случае 1-го поколения аденовирусов. Развитие иммунного ответа на вирусные белки может сопровождаться элиминацией внесенных терапевтических генов. Лентивирусы (ВИЧ) также способны к трансфекции неделящихся клеток, но они потенциально опасны для человека. Эффективен и перенос генов с помощью гемагглютинирующих вирусов, но применение этого вектора ограничено неспецифическим связыванием вирусов с эритроцитами. Перспективно использование аденоассоциированных вирусов — непатогенных, способных к трансфекции неделящихся клеток и обеспечению длительной экспрессии введенных терапевтических генов.

В целом вирусные векторы генной терапии характеризуются высокой эффективностью (но низким тропизмом к сосудам), возможностью применения как высоких, так и средних доз вирусов-«переносчиков», а также вариабельностью ядерной направленности. Возможно и системное, и локальное применение вирусных векторов. Наиболее эффективным считается Ad/lenti, а негативные результаты получены при попытках применения аденоассоциированного вируса AAV-2 (Gao et al., 2002; Gregorevic et al., 2005). Эффективность, селективность и ядерная направленность невирусных переносчиков генов существенно ниже.

Для механической доставки векторов в сосуд используют внутрисосудистые и периваскулярные доставочные системы, а также перикардиальные, интрамиокардиальные и внутримышечные инъекции. При облитерирующих заболеваниях сосудов локальное введение генетического материала целесообразнее системного, а при периваскулярном введении векторов локальная трансфекция выше, чем при эндолюминальном (A. Fernandez-Ortis et al., 1994; R. Kornowsky et al., 2000). Внутрисосудистую доставку векторов осуществляют как путем их непосредственной инфузии в просвет сосуда, так и с помощью модификаций баллонных катетеров для ангиопластики. Для периваскулярной доставки применяют специальные катетеры с иглами, что позволяет избежать попадания генетического материала в системный кровоток. При облитерирующих заболеваниях сосудов нижних конечностей возможны также внутримышечные инъекции векторов в зоны ишемии. Введение векторов непосредственно в миокард осуществляют во время аортокоронарного шунтирования (АКШ) или из полости левого желудочка, применяя катетеры с иглами для трансэндокардиальных инъекций (R. Kornowsky et al., 2000).

Генная терапия как перспектива лечения больных ИБС

В стадии разработки находятся методы внутримиокардиального введения аденовирусных векторов для переноса генов, способных вызвать гиперплазию миоцитов, пациентам, перенесшим инфаркт миокарда. Внедрению их в клиническую практику препятствует как возникающее при этом повреждение кардиомиоцитов, так и иммуногенность аденовирусных векторных систем. В недавно опубликованной работе A. Abdel-Latif et al. (2006) продемонстрировано свойство трансформирующего фактора роста TGF-β1 усиливать потенциал кардиомиогенной дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток скелетных мышц in vitrо. Изучается кардиомиогенный потенциал одного из важнейших промоторов ангиогенеза — сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF (в работе M. Guerrero еt al. (2006) — также с применением аденовирусного вектора).

Перспективным методом генной терапии при ИБС является терапевтический ангиогенез — введение в область ишемии ангиогенных факторов или их генов для стимуляции развития сосудов и улучшения кровотока в тканях, ограничения зоны ишемии и улучшения отдаленного прогноза. Ценность этих разработок очевидна, учитывая столь существенные недостатки малоинвазивной хирургии сердца, как невозможность реваскуляризации коронарных ветвей 2-го порядка и риск окклюзии шунта из-за развития тромбоза и гиперплазии интимы.

Естественными ангиогенными стимулами являются ишемия, гипоксия, воспаление, механическое растяжение и некроз. Неоваскуляризация тканей идет по двум путям. Истинный ангиогенез представляет собой ответвление новых капилляров от существующих, что увеличивает их плотность в зоне ишемии и доставку крови в нее. Неоартериогенез — это трансформация предсуществующих артериол в небольшие артерии мышечного типа и ремоделирование предсуществующих коллатералей, что обеспечивает обходной кровоток.

По данным M. Gaballa et al. (2006), гипоксия стимулирует ангиогенез, активируя 128 генов ростовых факторов и провоспалительных цитокинов, в т.ч. гены ангиопоэтина 1/2, CSF, PDGFa/b, EGF-β, EGF-R3, TGF-β, VEGF-β, VG5Q, IL-1β, IL-6, MMP2/9, Ephrin A1/A2/A3, нейтрофиллина, урокиназы и т.д. Что касается ангиопоэтина (Ang), то Lei Ye et al. (2006) сравнивали в эксперименте прямое введение аденовирусного вектора, несущего ангиопоэтин (Ad-Ang-1), и опосредованное трансдукцией скелетных миобластов: во втором случае влияние на перфузию мышц было более выраженным. В текущем же году Jung-Kyu Han et al. сообщили о свойстве PPAR-δ значительно повышать васкулогенный потенциал эндотелиальных клеток-предшественников in vitro и in vivo.

Среди множества факторов регуляции процессов неоваскуляризации наиболее важны факторы роста фибробластов (FGF-1, FGF-2, FGF-5), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), индуцируемый гипоксией транскрипционный фактор (HIF-1a), трансформирующий фактор роста (TGF-β), фактор роста гепатоцитов (НGF), моноцитарный хемотактический протеин-1, урокиназа и т.д.

На сегодня наиболее изучены и чаще используются FGF и VEGF. Многочисленные эксперименты показали большую эффективность и безопасность введения именно генов (плазмидной ДНК) этих ростовых факторов без применения аденовирусных векторов и затрат на использование рекомбинантных белков.

VEGF является селективным митогеном для эндотелиальных клеток; этот гликопротеин продуцируют различные клетки, в т.ч. эндотелиальные в состоянии аноксии. В работе J. Isner et al. (1996) стимуляция ангиогенеза достигалась с помощью интрамиокардиального (после торакотомии) введения плазмидной ДНК VEGF, что через 1–2 мес. позволило уменьшить ишемию и увеличить коллатеральный кровоток у 5 пациентов.

Известно, что применение VEGF сопровождается увеличением сосудистой проницаемости и развитием тканевого отека. В работе Natsuo Inoue et al. (2006) показано, что в ответ на ишемию ткани химерические гены pVEGF-E/PIGF9 и pVEGF-E/PIGF33 значительно стимулируют ангиогенез, и в отличие от VEGF-А применение VEGF-Е не вызывает отека.

Рекомбинантный базисный фактор роста фибробластов (bFGF) применяли в исследовании J. Udelson et al. (2000) у пациентов с рефрактерной стенокардией; фактор вводили внутрикоронарно (n = 45) или в/в (n = 14). Через 3 мес. данные сцинтиграфии миокарда подтвердили усиление перфузии как в покое, так и при нагрузке.

Как показано в эксперименте Yoshio Arai et al. (2006) по терапевтическому ангиогенезу / артериогенезу, одновременное введение bFGF и мощного вазодилататора PgE1 оказалось эффективнее их последовательного применения и монотерапии bFGF.

К 2000 г. в литературе имелись данные об 11 клинических испытаниях по терапевтическому ангиогенезу при ИБС (в 5 исследовали рекомбинантные факторы роста, в 6 — их гены), но ни одно не было двойным слепым плацебо-контролируемым. Краткосрочная эффективность и переносимость терапевтического ангиогенеза с использованием генов ростовых факторов при ИБС была удовлетворительной. В табл. 2 представлены сведения о клинических исследованиях по ангиогенезу на 2003 г.

Исследования по терапевтическому ангиогенезу при ИБС продолжаются. В текущем году G. Barbeau et al. сообщают результаты рандомизации 116 пациентов в международное мультицентровое двойное слепое плацебо-контролируемое исследование, проводимое с целью оценить влияние введения аденовирусного гена, кодирующего FGF (Ad5FGF-4), на толерантность к физической нагрузке (ТФН) через 12 недель, а также безопасность этого гена у пациентов со стабильной стенокардией. В течение года также оценивали общую смертность и нефатальные коронарные события. Пациентам 1-й группы интракоронарно вводили низкую дозу Ad5FGF-4 (10Е9), 2-й — высокую (10Е10), 3-я группа получала плацебо. Различий по показателям ТФН между группами не фиксировали. У 6 пациентов из основных групп регистрировали транзиторную лихорадку и менее чем 2-кратное нарастание активности печеночных ферментов.

Генная терапия при рестенозах

Все большему количеству пациентов с ИБС проводят транслюминальную баллонную коронароангиопластику (ТБКА), АКШ, а также минимальное инвазивное прямое шунтирование коронарных артерий (MIDCAB) и стентирование. Рестеноз есть повторное сужение просвета сосуда, возникающее в 20–30 % случаев и ведущее к возврату симптомов ишемии.

В текущем году D. Pons et al. представили результаты изучения влияния полиморфизма гена противовоспалительного цитокина IL-10 (в норме ингибирующего IL-1β) на риск рестенозов после коронароангиопластики (проспективное мультицентровое исследование GENDER): выявлены 3 модификации этого гена, ассоциированные с развитием рестенозов. Возможно, скринирование пациентов на эти генотипы IL-10 в дальнейшем поможет стратификации риска рестенозов.

Рестеноз является комплексным репаративным ответом на повреждение сосуда, сходным с атеросклеротическим процессом; механизмы его развития представлены в табл. 3. Такие факторы, как временные рамки развития рестенозов артерий и возможность профилактического внесения терапевтических генов в процессе выполнения операций, позволили исследовать возможности генной терапии в этом аспекте. Специфическое воздействие генов на определенные клетки должно быть транзиторным и строго локализованным; его задачи — ускорение реэндотелизации, уменьшение тромбообразования, пролиферации, миграции и избыточного синтеза матрикса.

Среди прочих стратегий генной терапии рестенозов (табл. 5) наиболее разработана антипролиферативная, поскольку именно это звено патогенеза традиционно считалось ведущим.

Применив ретровирус для генного переноса, Nabel et al. около 10 лет назад показали роль FGF-1 в развитии гиперплазии интимы, ангиогенезе и неоваскуляризации атеросклеротических бляшек. Стало известным влияние TGF-β1 на репарацию сосудов — посредством усиления выработки внеклеточного матрикса в интиме и медии сосудистой стенки, а также роль PDGF в увеличении количества гладкомышечных клеток. Мощным стимулятором роста и пролиферации гладкомышечных структур и биосинтеза коллагена является ангиотензин, и ранее проведенные исследования Morishita et al. показали возможность применения генных технологий (на уровне ДНК-протеина) для снижения активности тканевого АПФ сосудистой стенки без влияния на системное кровообращение. Тогда же исследование Von der Leyen et al. продемонстрировало, что перенесение гена, кодирующего эндотелиальную NO-синтазу, угнетает гиперплазию интимы и улучшает реакцию сосудов на вазодилатирующие стимулы. В 2001 г. West et al. показали значительный регресс гиперплазии гладкомышечных клеток интимы на 28-й день после введения в сосуд nNOS-трансгена.

Активно изучается влияние на процессы рестенозирования сосудов таких факторов, как VEGF, HIF-1a, матриксных металлопротеаз (MМPs) и их тканевых ингибиторов (TIMPs), роль факторa транскрипции E2F, ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA/cdc2), циклинзависимых киназ (CDK1, CDK2) и их ингибитора — белка р21.

Подавление миграции гладкомышечных клеток в стенке сосуда представляется не менее важным направлением генной терапии, чем угнетение пролиферации интимы. Мишенями при этом являются MMPs (матриксные металлопротеазы — коллагеназа, стромелизин, желатиназа) и их тканевые ингибиторы, в частности TIMP-3. По данным Bond et al. (2000, 2002), Baker et al. (2002), ингибирование активации MMPs предотвращает протеолиз матрикса и последующую миграцию гладкомышечных клеток. Так, через 28 дней после трансплантации TIMP-3 George et al. (2000) отмечали регресс гиперплазии сосудистой стенки; в исследовании Wan et al. (2004) было показано сохранение эффекта этого варианта терапии через 3 месяца.

В работах J.M. Isner et al. (1996), T. Van Belle et al. (1997), M. Laitinen et al. (2000) было показано, что введение гена VEGF не только ускоряет реэндотелизацию после баллонной ангиопластики и стентирования, но и подавляет рост неоинтимы и снижает частоту тромбозов.

Как видим, генная терапия рестеноза несколько «отстает» от терапевтического ангиогенеза как лечебной стратегии при ИБС. В т.ч. ее клиническое применение ограничивает преимущественное использование аденовирусных векторных систем доставки генов в клетки сосудистой стенки — из-за риска побочных реакций.

В заключение следует отметить реалистичность и перспективность применения генной терапии, в т.ч. и вирусных векторов, в кардиологии. Возможности ее комбинирования с фармакотерапией, фотодинамической, клеточной терапией (например, введение генов в стволовые клетки) изучены недостаточно и требуют дальнейших исследований.

Подготовила О.Г. Пузанова, к.м.н.,
кафедра пропедевтики внутренних болезней № 1,
Национальный медицинский университет
имени А.А.Богомольца