Международный эндокринологический журнал 6 (38) 2011

Вступ

Ключове місце у програмі ранньої діагностики інсулінорезистентності та цукрового діабету (ЦД) займають піруватдегідрогеназний (ПДГ) та альфа-кетонуричний тести [2, 4]. Згідно з результатами досліджень А. Штейнерга та Р. Уїльдера [1], спадкова схильність населення до ЦД становить 20–25 %. При цьому загальна частота діабету (діагностованого, недіагностованого та потенційного) перевищує 5 %.

Мета роботи — вивчення станів гормональної регуляції вуглеводного обміну у людей Прикарпатського регіону за даними піруватдегідрогеназного та альфа-кетонуричного тестів.

Матеріали та методи дослідження

Обстежено 31 579 практично здорових осіб (віком від 6 місяців до 80 років), що імітують загальну популяцію, із застосуванням піруватдегідрогеназного та альфа-кетонуричного тестів. Лабораторні дослідження виконувалися на 120-й хвилині глюкозотолерантного тесту (ГТТ). Вуглеводний сніданок містив 100 г вуглеводів (200 г білого хліба і 20 г (три чайні ложки) цукру на 300 мл води). Може бути використана глюкоза (50 г на 1 м2 поверхні тіла — для дорослих і 40 г на 1 м2 поверхні тіла — для дітей, простіше — 1,75 г на 1 кг маси тіла дитини, але не більше за 75 г. Стандартна доза глюкози для дорослих — 75 г.

Площу поверхні тіла визначають за таблицями (табл. 1–3), що складені нами виходячи з таких даних: новонароджені — 0,2–0,3 м2; 10 кг — 0,5 м2; 30 кг — 1,0 м2; 50 кг — 1,5 м2; 70 кг — 1,7 м2.

Визначення функціонального стану  піруватдегідрогеназної системи мітохондрій

При обстеженні піруватдегідрогеназний тест використовується з метою виявлення шести станів гормональної регуляції вуглеводного обміну та диференціації інсулінорезистентності вітамінонезалежної (спадкової схильності до ЦД) і В1-гіповітамінозу, що відображений показниками зниженої функціональної активності піруватдегідрогеназного комплексу та надмірної екскреції з сечею альфа-кетокислот.

В основу фериціанідного методу визначення активності піруват- та альфа-кетоглютаратдегідрогенази мітохондрій покладений принцип відновлення фериціаніду калію (K3[Fe(CN)6]), що нерозривно пов’язане з окисленням кетокислоти. Для зручності у прописі наведені не тільки назви реактивів, але і склад проби, що підлягає інкубації.

У дослідну і контрольну пробірки вносять реактиви згідно з табл. 4.

Дослідну пробу інкубують 20 хв при 37 °С у водяній бані або термостаті (для спрощення процедури пацієнт може тримати пробірку в кулаку або під пахвою). Після інкубації реакцію зупиняють, вносячи у пробірку 0,3 мл 50% розчину трихлороцтової кислоти (ТХО). У контрольну пробірку ТХО вносять безпосередньо після забору крові.

Далі проби центрифугують і фотометрують проти Н2О на фотоелектроколориметрі (ФЕК, синій світлофільтр, 440 нм, кювета з довжиною оптичного шляху 5 мм) або спектрофотометрі при 417 нм. Кількість відновленого фериціаніду калію визначають за калібрувальною кривою, активність ферменту визначають у мкмоль/(с-л) або мккат/л (табл. 5).

Наведені показники оптичної щільності використовуються для побудови калібрувальної кривої розведень стандартного розчину фериціаніду (табл. 6).

Результати виконаних досліджень (табл. 7) підтверджують наявність лінійної залежності величин оптичної щільності від показників вмісту фериціаніду в пробі.

Визначено ціну сотої частки (0,01) шкали ФЕК у мкмоль/(с-л) ПДГ-активності крові:

де 6,7 — концентрація фериціаніду, мкмоль/мл; 0,7 — об’єм розчину фериціаніду в пробі, мл; 0,01 — коефіцієнт для перерахування на соту частку шкали ФЕК; 1000 — коефіцієнт для розрахунку в мкмоль/л; 0,35 — оптична щільність стандартного розчину фериціаніду (4,69 мкмоль у пробі); 0,04 — кількість крові, витраченої для аналізу, мл;

У результаті складено формулу для обчислення ПДГ-активності крові:

ПДГ-активність крові, мкмоль/(с.-л) =

= (К – Д) ´ 2,79167,

де К — оптична щільність контролю; Д — оптична щільність досліду; інші показники є аналогічними даним попередньої формули.

Полегшує розрахунки табл. 7.

У здорових людей ПДГ-активність крові відображена величинами оптичної щільності у межах 0,03–0,06, що становить 8,4–16,8 мкмоль/(с.-л), М = 12,6 ±  ± 0,15 мкмоль/(с-л), Р < 0,01.

Визначення сумарного вмісту  альфа-кетокислот у сечі модифікованим  методом Умбрайта

Принцип. Піруват- та альфа-кетоглютарат сечі конденсуються з 2,4-динітрофенілгідразином (ДНФГ) з утворенням гідразону, що в лужному середовищі дає червоно-оранжеве забарвлення розчину. Його інтенсивність пропорційна концентрації кетокислоти.

Обладнання:

1. Фотоелектроколориметр (ФЕК).

2. Дві пробірки (5 мл).

3. Піпетка (1 мл).

Реактиви:

1. Розведена соляна кислота (HCl, 8,33%).

2. Солянокислий 0,1% розчин ДНФГ. 50 мл реактиву розчиняють у 30 мл розведеної соляної кислоти (8,33%) при слабкому підігріванні суміші. Розчин залишають до наступного дня, потім його об’єм доводять до 50 мл дистильованою водою.

3. Розчин натрію гідроокису (NaOH) — 12 г/100 мл.

Хід визначення

У дві пробірки (5 мл) — дослідну (Д) і контрольну (К) вносять розчини, наведені у табл. 8.

Вміст пробірок змішують після додавання кожного реактиву і на 20 хв залишають у темному місці при кімнатній температурі. Потім у пробірки додають по 1 мл 12% розчину NaOH, змішують і через 5 хв колориметрують інтенсивність червоно-оранжевого забарвлення досліду щодо контролю (ФЕК, світлофільтр синій — 490 нм, кювета з довжиною оптичного шляху 5 мм). Показники оптичної щільності переводять у мкмоль/л, помноживши кожен із них на 5000.

Для обчислення сумарного вмісту альфа-кетокислот у сечі використовують табл. 9, 10.

Табл. 9 і 10 складені на підставі даних калібрувальної кривої розведень стандартного розчину пірувату — 5000 мкмоль/л (44 мг%) (табл. 11).

У здорових людей у 2-годинній прандіальній сечі рівень альфа-кетокислот становить 550–850 мкмоль/л, сумарний їх вміст є у межах 5,0–11,4 мг (Р < 0,05), у нічній сечі — 500–800 мкмоль/л і 12–24 мг (Р < 0,05), у 2-годинній сечі натще — 450–750 мкмоль/л і 4–7 мг (Р < 0,05).

Для візуальної діагностики п’яти ступенів інсулінорезистентності (I ступінь — 900 мкмоль/л (7,9254 мг%), II ступінь — 1800 мкмоль/л (15,85 мг%), III ступінь — 2700 мкмоль/л (23,78 мг%), IV ступінь — 3600 мкмоль/л, (31,70 мг%) і V ступінь — 4500 мкмоль/л (39,63 мг%)) використовують кольорову шкалу, яку можна зробити самому. З цією метою готують стандартний розчин пірувату (9000 мкмоль/л, або 79,254 мг%: 50 мг пірувату натрію (відповідає 40 мг чистої піровиноградної кислоти) розчиняють у 50,47 мл Н2О. Потім готують розведення стандартного розчину (табл. 13).

Для аналізу відбирають по 0,1 мл розчину з кожного розведення, вносять у пробірки, додають по 0,5 мл Н2О і 0,4 мл 0,1% розчину 2,4-динітрофенілгідразину, а через 20 хв — 1 мл 12% розчину NaOH. Через 5 хв забарвлений еталон фотографують, використовуючи кольорову плівку, з метою поширення «Програми самоконтролю вуглеводного обміну».

Сумарний вміст альфа-кетокислот у сечі визначають, помноживши показник рівня кетокислот у мг% на об’єм порції сечі у мл. Отриманий результат ділять на 100 мл.

Приклад. У сечі об’ємом 200 мл рівень альфа-кетокислот становить 15,85 мг% (1800 мкмоль/л). Звідси вміст альфа-кетокислот дорівнює 15,85 мг% ´ 200 мл : 100 мл = 31,7 мг. Зручніше користуватися табл. 14.

Асоційовані показники 2-годинної альфа-кетонурії та ПДГ-активності крові на 120-й хвилині ГТТ надають можливість диференціювати шість станів гормональної регуляції вуглеводного обміну в організмі (табл. 14).

Методика обчислення динаміки поширеності цукрового діабету в Україні за останні 60 років

З огляду на гіпотезу про автосомно-рецесивне успадкування ЦД і беручи до уваги частоту зареєстрованого ЦД у 1950 році за 1 % (100 на 10 000 населення), А. Штенберг та Р. Уїлдер теоретично визначили, що спадкова схильність населення до ЦД на той час становить 20–25 % [1]. У «Протоколі надання медичної допомоги хворим на цукровий діабет» зазначено, що в Україні зареєстрована поширеність ЦД становить 2,4 %, а число хворих на ЦД подвоюється впродовж кожних 12–15 років, що викликає певні сумніви [3]. Тому виникла необхідність дослідити фактичну динаміку частоти ЦД в Україні за останні 60 років (1950–2010) та скласти епідеміологічний прогноз до 2036 року [5].

Для обчислення динаміки поширеності ЦД в Україні за останні 60 років використано запропоновану нами формулу. Стає очевидним, що порівняно з 1950 роком кількість хворих на ЦД збільшилася вдвічі впродовж 43 років і досягла рівня 2 % (200 на 10 000 населення) у 1993 році.

Визначено спадкову схильність населення до ЦД; за параметрами функціонального стану циклу Корі та піруватдегідрогеназної активності крові вона становить 32,42 % (табл. 16).

Подібним чином визначають тривалість періоду потроєння частоти ЦД. Виконані обчислення показали (табл. 15), що число хворих на ЦД подвоїлося впродовж 43 років — у 1950 році поширеність ЦД становила 1 % (100 хворих на 10 000 населення), а в 1993 році — 2 % (200 хворих на 10 000 населення); у 2036 році доказова частота ЦД становитиме 3 % (300 хворих на 10 000 населення), тобто за 86 років (1950–2036) частота ЦД утричі збільшиться порівняно з 1950 роком.

Результати дослідження  та їх обговорення

За звітний період обстежено 31 579 людей Прикарпатського регіону із застосуванням альфа-кетонуричного та піруватдегідрогеназного тестів. Поглиблений статичний аналіз виконано при огляді 292 осіб (вік від 6 до 80 років), що імітують загальну популяцію.

У першу групу обстежених залучено 121 особу без факторів ризику щодо можливого розвитку ЦД. Це дало можливість побудувати криву нормального розподілу показників ПДГ-активності крові на 120-й хвилині ГТТ. Вона охоплює величини у межах 8,14–16,30 мккат/л: n = 121 (41,44 %), М = 12,16 мккат/л ± 0,14 мккат/л, 3s = 4,14 мккат/л, М ± 3s = 8,02–16,30 мккат/л, що взято за норму; при цьому 2-годинна альфа-кетонурія перебувала у межах 5,0–11,4 мг.

Показники вуглеводного обміну, отримані в період вуглеводного навантаження, відображають функціональний стан циклу трикарбонових кислот та ПДГ-системи мітохондрій. Такий підхід дозволяє зробити висновок, що частота фізіологічної активності цих систем у загальній популяції становить 41,44 % (у 121 особи із 292 обстежених, Р < 0,01).

Другу групу обстежених становлять 94 практично здорові особи (32,19 % загальної популяції), у яких діагностовано вітамінонезалежну інсулінорезистентність у циклі трикарбонових кислот (ендогенна або спадкова схильність до ЦД). Маркерами такої інсулінорезистентності є величини підвищеного вмісту альфа-кетокислот у 2-годинній прандіальній сечі (11,9–40,0 мг) на фоні нормальної ПДГ-активності крові (8,0–16,30 мккат/л).

До третьої групи залучено 22 особи (7,53 % загальної популяції), в яких виявлено біохімічні маркери вітамінозалежної інсулінорезистентності у циклі трикарбонових кислот (ЦТК): підвищені показники 2-годинної прандіальної альфа-кетонурії (12,0–29,0 мг) на фоні ПДГ-недостатності мітохондрій (3,40–7,80 мккат/л).

До четвертої групи обстежених залучено 45 осіб зі збільшенням щитоподібної залози І–ІІ ступенів, у яких виявлено синдром контрінсулярної недостатності (гіпотиреоз, йододефіцитний стан). Його прояви: низька ПДГ-активність крові (2,03–7,80 мккат/л), що реєструється в осіб із показниками нормальної (6,0–11,0 мг) або пониженої (3,0–4,9 мг) 2-годинної прандіальної альфа-кетонурії. Це можна вважати за легкий ступінь зобної ендемії, що реєструється у 15,41 % людей Прикарпатського регіону згідно з критеріями, рекомендованими ВООЗ (1994).

Окремо виділено п’яту групу (7 осіб, або 2,40 % загальної популяції), в яких діагностовано гіперінсулінізм мітохондріальний (ПДГ — гіпертолерантність до глюкози): 2-годинна прандіальна альфа-кетонурія не перевищувала 9 мг на фоні підвищеної ПДГ-активності крові у межах 17,47–26,00–60,00 мккат/л і надмірної маси тіла при підвищеному апетиті.

У шостій групі — 3 особи з ендогенним синдромом Сомоджі, надмірною масою тіла та підвищеним апетитом. Маркерами реактивної гіперконтррегуляції були показники надмірної екскреції з сечею альфа-кетокислот у межах від 14 до 16 мг за 2 години після стандартного вуглеводного сніданку як відповідь на гіперінсулінемію, що відображена показниками підвищеної ПДГ-активності крові (17,47–26,60 мккат/л). Частота ендогенного синдрому Сомоджі у загальній популяції — 1,03 %.

Проведені дослідження дають підставу рекомендувати критерії діагностики шести станів гормональної регуляції ЦТК та піруватдегідрогеназної системи мітохондрій, n = 292 (табл. 16).

Висновки

1. Виконані дослідження дають підставу рекомендувати критерії діагностики шести станів гормональної регуляції циклу трикарбонових кислот та піруватдегідрогеназної системи мітохондрій.

2. Період, упродовж якого в Україні кількість хворих на ЦД подвоюється, становить 43 роки (1 % у 1950 році і 2 % — 1993 році).

3. Утричі збільшиться частота ЦД до 2036 року (300 на 10 000 населення), якщо показник щорічного приросту поширення ЦД не перевищуватиме 2,33 хворого на 10 000 населення.