Международный эндокринологический журнал 6 (54) 2013

Однією зі зв’язуючих ланок цукрового діабету (ЦД) та частоти й тяжкості перебігу цереброваскулярної патології є взаємне посилення автоімунних процесів, притаманне кожному із зазначених патологічних станів. Імунний гомеостаз значною мірою залежить від співвідношення процесів проліферації та апоптозу тимоцитів, які практично не досліджені за умов поєднання ЦД з ішемією­реперфузією головного мозку. Важливим маркером активності мітотичних процесів клітин є ядерний антиген клітинної проліферації PCNA, тому ми поставили за мету вивчити вплив ішемії­реперфузії головного мозку на експресію PCNA в тимоцитах та структуру PCNA⁺­клітин лімфоїдної популяції тимуса в контрольних щурів і тварин із ЦД.

Матеріал і методи дослідження. Дослідження проведено на шестимісячних білих нелінійних контрольних щурах та тваринах того ж віку з чотиримісячним стрептозотоцин­індукованим ЦД (стрептозотоцин Sigma, США, 60 мг/кг маси внутрішньочеревно однократно). У дослід брали щурів із рівнем глікемії вище ніж 10 ммоль/л. Неповну глобальну ішемію мозку моделювали 20­хвилинним кліпсуванням сонних артерій. На 12­ту добу після ішемії­реперфузії мозку тварин виводили з експерименту декапітацією під каліпсоловим наркозом. Проліферативну активність тимоцитів вивчали за експресією ядерного антигена клітинної проліферації PCNA — кофактора ДНК­полімерази дельта, необхідного для реплікації ДНК у S­фазі. Зрізи тимуса після відповідної проводки інкубували з первинними антитілами — мишачими IgG2а до PCNA щура (Sigma Chemical, США) у вологій камері при t = 4 °С. Надлишок первинних антитіл відмивали в 0,1 М фосфатному буфері, зрізи інкубували 60 хв (t = 37 °С) зі вторинними антитілами (антитіла кролика до повної молекули IgG миші, кон’юговані з FITC (Sigma Chemical, США)), промивали 0,1 М фосфатним буфером, поміщали в суміш гліцерину й фосфатного буфера (9 : 1) для люмінесцентної мікроскопії. Для опрацювання зображення вводили в комп’ютерну систему цифрового аналізу VIDAS­386 (Kontron Elektronik, Німеччина).

Результати дослідження та їх обговорення. Судячи зі зростання концентрації білка PCNA в контрольних щурів ішемія­реперфузія головного мозку посилила експресію PCNA у великих, середніх та малих тимоцитах кіркової зони. Це можна розцінити як посилення мітотичних процесів у даних клітинах тимуса, що підтверджується й зростанням у залозі тварин даної експериментальної групи сумарної щільності розташування PCNA+­тимоцитів, що відбулося переважно за рахунок середніх лімфоцитів.

Чотиримісячний ЦД посилив експресію PCNA в лімфобластах, великих та середніх тимоцитах кіркової зони, однак у малих тимоцитах, найбільш зрілих та функціонально активних, концентрація PCNA знизилася. Аналіз щільності різних класів тимоцитів свідчить, що у тварин даної серії, незважаючи на зростання сумарної щільності PCNA⁺­тимоцитів, щільність PCNA⁺­лімфобластів, великих та середніх тимоцитів вірогідно знизилася, а отже, сумарна кількість зросла суто за рахунок малих тимоцитів, однак якщо брати до уваги, що експресія PCNA у клітинах цього класу знизилася, у цілому активність проліферативних процесів також зменшується. Зростання ж сумарної щільності PCNA⁺­тимоцитів можна розглядати як компенсаторну реакцію залози на пригнічення мітотичних процесів. У щурів із поєднанням ЦД та ішемії­реперфузії головного мозку концентрація PCNA знизилася в лімфобластах і великих та малих тимоцитах, що в цілому свідчить про суттєве пригнічення проліферативних процесів. Сумарна щільність PCNA⁺­тимоцитів та малих тимоцитів у тварин даної експериментальної групи знижується, однак щільність PCNA⁺­лімфобластів, великих та середніх тимоцитів вірогідно зростає. Можна думати, що пригнічення експресії PCNA у всіх класах тимоцитів компенсується зростанням їх кількості, однак на етапі досягнення зрілості кількість проліферуючих малих лімфоцитів різко зменшується.

У мозковій зоні тимуса контрольних тварин після ішемії­реперфузії головного мозку в усіх класах тимоцитів концентрація PCNA зросла, що узгоджується зі зростанням як сумарної щільності PCNA⁺­тимоцитів, так і всіх класів клітин за винятком малих і свідчить про посилення їх проліферативної активності. Практично такі ж зміни вмісту PCNA виявлено в даній зоні щурів із ЦД. Аналіз структури класів тимоцитів у тварин даної групи показав зниження кількості малих PCNA⁺­тимоцитів при одночасному зростанні числа малих та середніх клітин, що, однак, не запобігало зниженню сумарної кількості PCNA⁺­лімфоцитів. Отже, ситуація в цій зоні залози за умов ЦД дещо протилежна тій, що у тварин даної експериментальної групи мала місце в кірковій зоні: тут зниження загальної кількості проліферуючих ти­моцитів дещо нівелюється посиленням експресії PCNA в усіх класах клітин. Ішемія­реперфузія мозку на тлі ЦД не змінює сумарну кількість PCNA⁺­тимоцитів, однак суттєво знижує кількість малих PCNA⁺­клітин. Хоча при цьому зростає кількість усіх інших PCNA⁺­класів клітин, проте експресія PCNA в усіх класах тимоцитів знижується. Отже, сумарна оцінка даних при поєднанні ЦД та ішемії­реперфузії мозку дозволяє говорити про зниження проліферативної активності тимоцитів, особливо зрілих, функціонально активних.

Висновки

1. У контрольних щурів ішемія­реперфузія головного мозку посилює проліферативну активність усіх досліджених класів тимоцитів кіркової та мозкової зон залози.

2. Ішемія­реперфузія головного мозку у тварин із цукровим діабетом пригнічує експресію PCNA в усіх класах клітин лімфоїдної популяції мозкової зони ти­муса та в лімфобластах і великих лімфоцитах — кіркової, що на тлі зниження сумарної кількості клітин у кірковій зоні та малих тимоцитів в обох зонах свідчить про пригнічення проліферації найбільш зрілих функціонально активних класів клітин.