Журнал «Боль. Суставы. Позвоночник» 4 (16) 2014

Статья опубликована на с. 79-86

Вступ

Остеоартроз посідає одне з провідних місць у структурі суглобової патології. Розвиток патологічних процесів у суглобовому хрящі поєднаний із порушенням структури капсули суглоба. При дослідженні суглобового хряща колінного суглоба щурів експериментально встановлено, що антенатальна дія антигенів є фактором ризику розвитку остеоартрозу [3]. Разом з цим деякі вчені вважають, що саме дезорганізація капсули суглоба як органу відіграє провідну роль у пошкодженні суглобового хряща [11]. Будова капсули суглоба протягом тривалого часу була й залишається об’єктом дискусій. Зміни в капсулі суглоба після антенатальної дії антигенів вивчені недостатньо.

Мета дослідження: встановити особливості формування капсули суглоба після антенатальної дії антигену.           

Матеріал і методи дослідження

Об’єктом дослідження стали 168 кульшових суглобів білих лабораторних щурів. Досліджували три експериментальні групи тварин: перша — інтактні щури; друга — антигенпремійовані щури, яким вводили 0,05 мл імуноглобуліну людського нормального; третя — контрольні щури, яким вводили 0,05 мл фізіологічного розчину. Введення антигенів та фізіологічного розчину проводили плодам на 18-ту добу внутрішньоутробного життя за методом М.А. Волошина [1]. Щурів виводили з експерименту під ефірним наркозом шляхом декапітації з 13:00 до 14:00 на 1-шу, 7-му, 14, 30, 45, 60 та 90-ту добу постнатального життя. При роботі з експериментальними тваринами керувалися «Європейською конвенцією із захисту хребетних тварин, які використовуються в експериментальних та інших наукових цілях» (Страсбург, 18.03.1986). У щурів вимірювали куприково-тім’яну відстань, довжину стегна, гомілки та ступні (у міліметрах). Обчислювали відношення стегна, гомілки та ступні до куприково-тім’яної відстані. Фрагменти кульшових суглобів фіксували в рідині Буена, декальцинували у 20% розчині мурашиної кислоти та зневоднювали у висхідній батареї спиртів та хлороформів. Шматочки заливали в суміш парафіну, воску й каучуку у співвідношенні 20 : 1 : 1. Серійні гістологічні зрізи виготовляли завтовшки 3–5 мкм. Для оглядової мікроскопії зрізи забарвлювали гематоксиліном та еозином. Для встановлення відносної площі розподілу колагенових волокон, основної речовини та клітин зрізи забарвлювали за методом Малорі, а з метою виявлення еластичних волокон — за Хартом. Серед колагенових волокон виділяли оформлені (згруповані в пучки) та неоформлені (незгруповані, поодинокі або орієнтовані хаотично, під кутом одне до одного). Увесь комплекс глікозаміногліканів (ГАГ) виявляли розчином альціанового синього при рH 2,6 із критичною концентрацією MgCl₂ 0,2 М. Диференціювання несульфатованих і сульфатованих ГАГ проводили після обробки зрізів тестикулярною гіалуронідазою. Виявлення PNA⁺-лімфоцитів проводили із застосуванням лектинів арахісу (PNA), вуглеводних залишків a-D-манози (Man) — горошку посівного (VSA), використовуючи стандартні набори лектинів науково-виробничого об’єднання «Лектинтест» (м. Львів). Контрольні зрізи інкубували в 1% розчині HJO₄ протягом 30 хвилин. Візуалізацію ділянок зв’язування лектинів проводили в системі «діамінобензидин — перекис водню». Уміст полісахаридів та інтенсивність відкладення бензидинової мітки оцінювали напівкількісно (від + до ++++). Товщину капсули суглоба вимірювали в ділянці labrum acetabulare та шийково-діафізарній зоні при імерсійному збільшенні мікроскопа (у мікрометрах) за допомогою окуляр-мікрометра МР-12. Обчислення відсотка компонентів сполучної тканини капсули суглоба проводили за допомогою методу кількісного візуального обліку морфологічних структур С.Б. Стефанова. Підрахунок клітин (юні, зрілі фібробласти, фіброцити, макрофаги та лімфоцити) проводили при імерсійному збільшенні мікроскопа за допомогою модифікованої окулярної сітки Глаголева на умовній одиниці площі з перераховуванням отриманих даних на 10 000 мкм². Мікрофотографування виконано на відеосистемі Aхiolab (Carl Zeiss, Німеччина) на об’єктиві x10, x40 та x100. Обробку отриманих числових результатів проводили за допомогою статистичних методів із використанням комп’ютерної програми Statistica® for Windows 6.1 (StatSoft Inc., № AXXR712D833214FAN5). Порівнювані результати вважали вірогідними при р < 0,05.

У капсулі суглоба виділяли вісцеральну, парієтальну та перехідну частини. Парієтальна частина капсули суглоба представлена синовіальним та фіброзним шаром. У синовіальному шарі виділяли вистеляючі клітини, базальну пластинку та міжклітинну речовину. Синовіальний шар, що покривав фіброзний шар, із парієтальної частини капсули надалі незмінно продовжувався на суглобові хрящі як вісцеральна частина капсули суглоба. Фіброзний шар межує з оточуючими тканинами та вплітається в суглобовий хрящ та кістки відповідно (терміни та класифікація капсули суглоба запропоновані нами) [2, 3, 6]. Усі дослідження проводили в парієтальній частині капсули.

Результати дослідження

У роботі встановлено, що вплив антигену в новонароджених призводить до підвищення загальної кількості лімфоцитів (4,50 ± 0,07 та 2,80 ± 0,07 (р < 0,05) відповідно). Пік вмісту загальної кількості лімфоцитів у капсулі суглоба антигенпремійованих тварин спостерігається на 7-му (7,7 ± 0,1 та 4,80 ± 0,09 (р < 0,05) відповідно) та 14-ту добу (7,50 ± 0,05 та 4,97 ± 0,09 (р < 0,05) відповідно). До 90-ї доби в капсулі суглоба кількість лімфоцитів у антигенпремійованих тварин зменшується, але вона залишається вірогідно більшою від контрольних (6,10 ± 0,07 та 5,10 ± 0,07 (р < 0,05) відповідно). Збільшення загальної кількості лімфоцитів у антигенпремійованих тварин відбувається головним чином за рахунок збільшення популяції PNA⁺-лімфоцитів із максимумом на 7-му добу (6,30 ± 0,08 та 2,90 ± 0,05 (р < 0,05) відповідно). З 14-ї доби кількість PNA⁺-лімфоцитів у антигенпремійованих тварин починає зменшуватись, проте вона залишається більшою від контрольних (5,90 ± 0,06 та 2,77 ± 0,04 (р < 0,05) відповідно). Підвищений вміст PNA⁺-лімфоцитів у тварин, які зазнали дії антигенів, спостерігається до 90-ї доби включно (3,10 ± 0,07 та 2,60 ± 0,07 (р < 0,05) відповідно). На тлі підвищеної частки лімфоцитів кількість макрофагів у новонароджених антигенпремійованих тварин порівняно з контрольною групою збільшується (7,40 ± 0,47 та 5,10 ± 0,97 (р < 0,05) відповідно). До 7-ї доби включно кількість макрофагів у антигенпремійованих залишається вірогідно більшою від контрольних (9,20 ± 0,85 та 6,30 ± 0,47 (р < 0,05) відповідно).

На тлі статистично вірогідного збільшення кількості лімфоцитів у антигенпремійованих новонароджених тварин (табл. 1, рис. 1) спостерігається збільшення відносного вмісту клітин (39,1 ± 0,6 % та 26,5 ± 1,9 %; р < 0,05) порівняно з тваринами інтактної та контрольної груп, що зберігається протягом усього періоду спостереження та має місце навіть на 90-ту добу (9,0 ± 0,5 % та 6,80 ± 0,47 %; р < 0,05). Відсоток основної речовини на 1-шу добу в антигенпремійованих щурів також підвищений (32,8 ± 0,4 % та 28,80 ± 0,42 %; р < 0,05) і залишається більшим до 14-ї доби включно (18,10 ± 0,23 % та 13,00 ± 0,31 %; р < 0,05). У новонароджених тварин, які зазнали дії антигену, звертає на себе увагу значне, майже у два з половиною рази, збільшення відносної площі розподілу еластичних волокон (4,2 ± 0,1 % та 1,70 ± 0,07 %; р < 0,05), що зберігається до 45-ї доби включно (44,00 ± 0,98 % та 34,80 ± 3,27 %; р < 0,05), цей відсоток починає знижуватися з 60-ї доби (25,70 ± 0,67 % та 47,50 ± 2,78 %; р < 0,05) і є вірогідно меншим навіть на 90-ту добу (30,60 ± 0,74 % та 37,7 ± 2,0 %; р < 0,05). На цьому тлі в антигенпремійованих тварин на 1-шу добу спостерігається суттєве, майже у два рази, зменшення відносної площі розподілу колагенових волокон (23,0 ± 1,1 % та 41,70 ± 3,68 %; р < 0,05), що має місце до 60-ї доби включно (68,20 ± 3,03 % та 73,6 ± 2,4 %; р < 0,05). Зменшення відсотка колагенових волокон відбувається головним чином за рахунок оформлених колагенових волокон як на 1-шу добу (5,60 ± 0,61 % та 10,50 ± 1,61 %; р < 0,05), так і на 60-ту (39,20 ± 0,48 % та 43,5 ± 1,3 %; р < 0,05). Проте відносна щільність неоформлених колагенових волокон у антигенпремійованих тварин є меншою порівняно з показниками контрольних тварин тільки на 1-шу добу (11,80 ± 0,49 % та 28,30 ± 2,07 %; р < 0,05), а з 7-ї доби вона починає значно збільшуватися (27,50 ± 0,62 % та 24,50 ± 0,61 %; р < 0,05) і залишається істотно вищою до 45-ї доби включно (35,50 ± 0,61 % та 27,70 ± 3,14 %; р < 0,05).

У новонароджених антигенпремійованих щурів на тлі статистично вірогідного збільшення кількості лімфоцитів та частки загального клітинного компонента спостерігається значне зниження кількості юних фібробластів, (17,10 ± 0,94 та 37,70 ± 1,99 (р < 0,05) відповідно), збільшення вмісту зрілих фібробластів (114,7 ± 1,1 та 92,30 ± 2,67 (р < 0,05) відповідно) та підвищення частки фіброцитів (14,40 ± 0,97 та 8,50 ± 1,36 (р < 0,05) відповідно). Зміни в популяції клітин фібробластичного ряду спостерігаються протягом усього експерименту й залишаються навіть на 90-ту добу у вигляді зниження кількості юних фібробластів (8,00 ± 1,43 та 12,04 ± 1,64 (р < 0,05) відповідно), збільшення вмісту зрілих фібробластів (70,40 ± 3,53 та 51,10 ± 2,22 (р < 0,05) відповідно) та зниження кількості фіброцитів (19,1 ± 2,1 та 32,9 ± 1,7 (р < 0,05) відповідно). З 1-ї по 14-ту добу постнатального життя в капсулі суглоба тварин, що зазнали дії антигену, встановлено збільшення частки гіалуронової кислоти та зменшення вмісту сульфатованих глікозаміногліканів і залишків D-манози.

У антигенпремійованих тварин на тлі змін розподілу клітин, волокон та основної речовини встановлено порушення динаміки товщини капсули суглоба, зокрема її істотне потоншення на 14-ту добу як у шийково-діафізарній зоні (92,50 ± 2,43 та 106,20 ± 3,27; р < 0,05), так і в ділянці labrum acetabulare (53,00 ± 2,37 та 64,20 ± 2,23; р < 0,05). Водночас у цій групі тварин виявлено порушення темпів приросту відділів тазової кінцівки, що особливо проявляється щодо ступні, а саме відбувається збільшення її абсолютної довжини на 1-шу добу (10,2 ± 0,3 та 8,1 ± 0,2 (р < 0,05) відповідно) та на 45-ту (33,6 ± 2,1 та 27,8 ± 1,8 (р < 0,05) відповідно), а також збільшення співвідношення «ступня — куприково-тім’яна відстань» на 1-шу добу (0,243 та 0,235), 14-ту (0,4 та 0,356), 30-ту (0,396 та 0,361), 45-ту (0,42 та 0,355) та 90-ту добу (0,333 та 0,318).

Обговорення отриманих результатів

Капсула суглоба — це складна структура, що забезпечує нормальне функціонування суглоба як органа. Встановлено, що антенатальна дія антигену може спричинити порушення розподілу клітин (зокрема, фібробластичного ряду), основної речовини, волокон, полісахаридів. Водночас експериментально отримано доліхостеномелію (подовження відділів кінцівок). Отримані дані співвідносяться з поняттям «дисплазія сполучної тканини» [4]. Антиген, що був введений плодам, є неспецифічним подразником для сполучної тканини. Його введення призводить до збільшення загальної кількості лімфоцитів, зокрема PNA⁺-лімфоцитів, що мігрують із тимусу на периферію [1]. Популяція PNA⁺-лімфоцитів — це як імунологічно незрілі CD⁸⁺/CD⁴⁺-лімфоцити, так і Т-лімфоцити. Останні після стимуляції антигеном Т-клітинного рецептора здатні продукувати інтерлейкін-17, гамма-інтерферон та TNF-aльфа, що впливають клітини, зокрема на фібробласти [10, 12, 14, 16]. Фібробласти та секреторні синовіоцити — головні типи клітин капсули суглоба, що виділяють гіалуронову кислоту завдяки ферменту гіалуронат-синтази, який значно активується при стимуляції інтерферонами та TNF-aльфа. Відомо, що гіалуронова кислота стимулює проліферацію та міграцію клітин, а також є потужним активатором біосинтезу еластичних волокон. Разом з цим aльфа-інтерферон, активізуючи синтез еластичних волокон, одночасно гальмує продукцію колагену фібробластами. З іншого боку, макрофаги в підвищеній кількості також можуть гальмувати синтез колагену фібробластами шляхом виділення інтерферонів. Останні сприяють секреції простагландину Е₂, що, з одного боку, є специфічним інгібітором біосинтезу колагену, а з іншого — стимулює синтез гіалуронової кислоти. Окрім того, макрофаги здатні до секреції протеаз, що сприяють деградації колагену. Гальмування формування колагенових волокон можна пояснити також дефіцитом вмісту манозокон’югатів та сульфатованих глікозаміногліканів [7, 8, 13, 15].

Збільшений відсоток еластичних волокон, неоформлених колагенових волокон, основної речовини та потоншення капсули суглоба є морфологічною картиною синдрому гіпермобільності суглобів (СГС). Зменшення частки оформлених колагенових волокон (що забезпечують міцність сполучної тканини) та сульфатованих глікозаміногліканів пояснює швидку стомлюваність, фізичну слабкість, періодичні немотивовані артралгії, деформації скелета при СГС. Вищеописані порушення, зокрема передчасне зниження щільності розподілу еластичних волокон після антигенного навантаження (табл. 1), пояснюють як вищу частоту, так і передчасний розвиток остеоартрозу в дітей із СГС, останній може розвиватися в дітей, які зазнали антенатального антигенного навантаження [5]. До того ж у етіології гонартрозу провідне місце посідає саме диспластичний компонент [9]. Тому антенатальне введення антигенів може застосовуватися з метою моделювання як доліхостеномелії, так і дисплазії компонентів кульшового суглоба з метою їх подальшого вивчення.

Висновки

Отже, антенатальна дія антигенів може призвести до розвитку диспластичних змін у капсулі кульшового суглоба, що проявляється у вигляді порушення розподілу полісахаридів, фібробластів, збільшення відсотка клітин, основної речовини, зменшення частки колагенових волокон, гіпереластичності сполучної тканини, та до більш раннього зменшення частки еластичних волокон, що може бути провідним рушійним фактором розвитку коксартрозу.