Мобильная версия

Коморбідний ендокринологічний пацієнт

Международный эндокринологический журнал 4 (76) 2016

Кальцифікація й апоптоз клітин крові як маркер наявності, тяжкості і прогресування ішемічної хвороби серця у поєднанні з цукровим діабетом 2-го типу: ультраструктурні та цитологічні дослідження

Авторы: Кияк Ю.Г., Когут М.А., Андрушевська О.Ю., Когут Л.М., Кияк Г.Ю., Барнетт О.Ю. - Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького, м. Львів, Україна

Рубрики: Эндокринология

Разделы: Клинические исследования

Актуальність. Збільшення внутрішньоклітинного вмісту Са2+ призводить до запуску процесів апоптозу і кальцифікації клітин крові та серцево-судинної системи. Тісний зв’язок між апоптозом клітин крові та їх кальцифікацією дає підстави вважати кальцій важливим маркером та ініціатором цього процесу. Мета роботи — дослідити ультраструктурні зміни та стан клітинного імунітету у пацієнтів з гострим коронарним синдромом (ГКС) і цукровим діабетом (ЦД) 2-го типу і виявити асоціацію між збільшенням внутрішньоклітинного кальцію в еритроцитах та кальцифікацією вінцевих артерій. Матеріали та методи. Обстежені 20 пацієнтів із ГКС у поєднанні з ЦД 2-го типу. Контрольну групу становили 10 осіб. Середній вік пацієнтів — 65,0 ± 5,6 року. Було проведено: мультиспіральну комп’ютерну томографію; цитологічне визначення солей кальцію в еритроцитах за методом Мак-Гі-Рассела; імунологічні дослідження апоптозу лейкоцитів за допомогою набору ApoLect; електронну мікроскопію для виявлення ультраструктурних ознак апоптозу клітин крові. Результати. У пацієнтів з високим і дуже високим індексом кальцифікації вінцевих артерій цитологічно спостерігається наявність в еритроцитах гранул кальцію різної величини і форми, фіолетово-синього забарвлення, анізо- та пойкілоцитоз еритроцитів; імунологічно — збільшення кількості апоптотично змінених і поява некротично змінених клітин крові; характерні також класичні ультраструктурні ознаки апоптозу лейкоцитів. Висновки. Наявність ГКС у пацієнтів із ЦД 2-го типу супроводжується активацією процесів апоптозу лейкоцитів, накопиченням іонів кальцію в еритроцитах, що асоціюється з високим і дуже високим індексом кальцифікації вінцевих артерій. Виявлення таких змін при дослідженні периферичної крові пацієнтів дає можливість вчасно запідозрити загрозу виникнення ішемічної хвороби серця й запобігти розвитку її тяжких ускладнень.

Актуальность. Увеличение внутриклеточного содержания Са2+ приводит к запуску процессов апоптоза и кальцификации клеток крови и сердечно-сосудистой системы. Тесная связь между апоптозом клеток крови и их кальцификацией дает основание считать кальций важным маркером и инициатором этого процесса. Цель роботы — исследовать ультраструктурные изменения и состояние клеточного иммунитета у пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС) и сахарным диабетом (СД) 2-го типа, выявить ассоциацию между увеличением внутриклеточного кальция в эритроцитах и кальцификацией коронарних артерий. Материалы и методы. Обследованы 20 пациентов с ОКС в сочетании с СД 2-го типа. Контрольная группа представлена 10 пациентами. Средний возраст пациентов составил 65,0 ± 5,6 года. Проведена мультиспиральная компьютерная томография; цитологическое определение солей кальция в эритроцитах по методу Мак-Ги-Рассела; иммунологические исследования апоптоза лейкоцитов с помощью набора ApoLect; электронная микроскопия для выявления ультраструктурних признаков апоптоза клеток крови. Результаты. У пациентов с высоким и очень високим индексом кальцификации коронарних артерий цитологически наблюдается наличие в эритроцитах гранул кальция различной величины и формы, фиолетово-синей окраски, анизо- и пойкилоцитоз эритроцитов; иммунологически — увеличение количества апоптотически измененных и появление некротически измененных клеток крови; характерными также являються классические ультраструктурные признаки апоптоза лейкоцитов. Выводы. Наличие ОКС у пациентов с СД 2-го типа сопровождается активацией процессов апоптоза лейкоцитов, накоплением ионов кальция в эритроцитах, что ассоциируется с высоким и очень високим индексом кальцификации коронарних артерий. Выявление данных изменений при исследовании периферической крови пациентов дает возможность своевременно заподозрить угрозу возникновения ишемической болезни сердца и предупредить развитие тяжелых ее осложнений.

Background. The increase of intercellular content of Ca2+ leads to the initiation of apoptosis processes and calcification of the cells of the blood and cardiovascular system. The close relationship between the apoptosis of blood cells and their calcification gives reason to believe that calcium is an important marker and initiator of this process. Objective of the study — to follow-up ultrastructural changes and the state of cellular immunity in patients with acute coronary syndrome (ACS) and type 2 diabetes mellitus (DM), and to identify the association between increased intracellular calcium in red blood cells and calcification of coronary arteries. Materials and methods. The study involved 20 patients with ACS associated with type 2 DM. The control group included 10 persons. The average age of patients was 65.0 ± 5.6 years. The following examinations were performed: multispiral computed tomography; cytological determination of calcium salts in red blood cells using McGee-Russell method; immunological study of leukocyte apoptosis by means of ApoLect set; electron microscopy for detection of ultrastructural signs of blood cell apoptosis. Results. In patients with high and very high index of calcification of the coronary arteries, the presence of calcium granules of various sizes and shapes in red blood cells can be detected cytologically, as well as aniso- and poikilocytosis; immunologically — an increase in the number of apoptotically altered blood cells and the appearance of necrotically modified ones; also, classic ultrastructural signs of leukocyte apoptosis are typical. Conclusions. The presence of ACS in patients with type 2 DM is associated with activation of leukocyte apoptosis processes, accumulation of calcium ions in red blood cells, which is accompanied by a high and very high index of calcification of the coronary arteries. Detection of such changes in the study of peripheral blood of patients enables to suspect timely the threat of coronary heart disease and to prevent its serious complications.

Ключевые слова

апоптоз, кальцифікація, гострий коронарний синдром, цукровий діабет 2-го типу, клітини крові.

апоптоз, кальцификация, острый коронарный синдром, сахарный диабет 2-го типа, клетки крови.

apoptosis, calcification, acute coronary syndrome, type 2 diabetes mellitus, blood cells.

Статтю опубліковано на с. 15-21

Вступ

Апоптоз — це природний процес генетично запрограмованої смерті клітин, на інтенсивність якого в організмі може впливати низка зовнішніх і внутрішніх чинників. Згідно із сучасними уявленнями, кількість клітин, які підлягають запрограмованій загибелі, залежить від співвідношення активаторів та інгібіторів апоптозу, тому апоптоз можна вважати індикатором дисбалансу в організмі про- та антиапоптотичних факторів, що впливають на ті чи інші клітини людського організму [1]. Порушення регуляції програмованої смерті клітин призводить до виникнення різних захворювань, пов’язаних із посиленням або, навпаки, інгібуванням апоптозу (вроджені чи набуті імунодефіцитні стани, автоімунні захворювання, онкопатологія). І, навпаки, багато захворювань, особливо життєво небезпечних, гострих або хронічних екзо- та ендогенних інтоксикацій і так звані хвороби цивілізації призводять до активації апоптозу. На особливу увагу заслуговують ішемічна хвороба серця (ІХС), артеріальна гіпертензія, гіперхолестеринемія, цукровий діабет (ЦД), гіподинамія, ожиріння, тютюнопаління та обтяжений спадковий анамнез, що викликають прискорене прогресування атеросклерозу через активацію в організмі різних механізмів апоптозу [2].

На сьогодні доведена важливість іонів кальцію у патогенезі серцево-судинних захворювань, а також фонових станів, що сприяють прогресуванню ІХС і гіпертонічної хвороби, погіршуючи їх перебіг та прогноз [8, 13]. Феномен кальцифікації артерій, що незмінно супроводжує прогресування атеросклерозу та виявляється різними візуалізуючими і морфологічними методами [10], є підтвердженням важливості розладів метаболізму кальцію в людському організмі [7]. Поряд із тим існують переконливі дані про безпосередній вплив іонів кальцію на різні ланки апоптозу клітин серцево-судинної системи. Зокрема, доведено, що на інтенсивність процесів апоптозу клітин впливає безліч ендогених фізіологічних факторів, а саме: оксид азоту, активні форми кисню, концентрація іонів (Ca2+ та Mg2+) і аденінових нуклеотидів (АДФ, АТФ), а також ліпіди, певні білкові фракції, зміни в складі Bcl‑2-комплексу [17].

Підвищення концентрації іонів кальцію в цитозолі клітин може бути наслідком як посилення його проникнення з міжклітинного простору через плазматичну мембрану, так і порушення його внутрішньоклітинного гомеостазу, що залежить від функції мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму. Збільшення внутрішньоклітинного вмісту Са2+ призводить до формування комплексу «циклофілін D — ANT», що індукує відкриття пор і запуск процесів апоптозу. Тісний зв’язок між іонами кальцію та процесами апоптозу клітин дає підстави вважати його важливим маркером та ініціатором цього процесу [1].

Хронічний метаболічний стрес внаслідок гіперглікемії [15], спричиненої дефіцитом інсуліну (ЦД 1-го типу) або зниженням толерантноcті тканин до інсуліну (ЦД 2-го типу), теж негативно впливає на клітинний гомеостаз практично всіх типів клітин [4]. Внутрішньоклітинні органели, такі як ендоплазматичний ретикулум та мітохондрії, разом із цитоплазматичною мембраною відіграють ключову роль у забезпеченні кальцієвої сигналізації. Надлишкова акумуляція Са2+ мітохондріями при ЦД суттєво порушує синтез АТФ і здатна істотно змінювати співвідношення АТФ/АДФ. Відомі дані, що при ЦД збільшується проникність мітохондріальних пор із подальшим швидким і масивним викидом Са2+ у цитозоль. Це призводить до порушення багатьох клітинних функцій і сприяє апоптозу [1, 18]. Зниження продукції АТФ, що виникає при цьому, ще більше порушує механізми кальцієвого гомеостазу через ослаблення Са2+-помпи і підвищення проникності плазматичної мембрани [16].

Дослідження клітин периферичної крові щодо виявлення ознак їх апоптозу [11, 12] у хворих із різними факторами ризику ІХС становить особливий науковий і практичний інтерес, оскільки вони повною мірою можуть відображати інтенсивність запрограмованої смерті клітин у людському організмі й є доступними щодо забору матеріалу для дослідження та дозволяють провести комплексний порівняльний аналіз із застосуванням імунологічних, морфологічних і біохімічних методик.

Мета дослідження — з’ясувати вплив різних факторів ризику ІХС на ультраструктурні зміни й апоптоз лейкоцитів і стан клітинного імунітету у пацієнтів із гострим коронарним синдромом (ГКС), а також виявити асоціацію між збільшенням внутрішньоклітинного кальцію в еритроцитах і кальцифікацією вінцевих артерій для поліпшення діагностики та корекції біохімічних змін у крові, що спричинюють розвиток ІХС.

Матеріали та методи

Обстежені 20 пацієнтів із ГКС, які перебували на стаціонарному лікуванні в кардіологічному відділенні лікарні швидкої медичної допомоги м. Львова (база кафедри сімейної медицини ФПДО ЛНМУ імені Данила Галицького), серед яких було 8 осіб із ЦД 2-го типу різного ступеня тяжкості, 12 — з ожирінням І–ІІІ ст. і два пацієнти — з професійними шкідливостями. Контрольну групу становили 10 практично здорових осіб. Середній вік пацієнтів — 65,0 ± 5,6 року. Обидві групи порівнянні за віковими та гендерними характеристиками.

Пацієнтам з ІХС проводили мультиспіральну комп’ютерну томографію (МСКТ) на томографі Somatom Volum Zoom (Siemens, Німеччина) за методом A. Agatston із використанням програми Calciumscoring. Кількісний аналіз кальцію здійснювали за алгоритмом, запропонованим A. Agatston та співавт. Кількість кальцію розраховували для окремих сегментів вінцевих артерій з підрахунком загального кальцієвого індексу [3, 9].

Цитологічне визначення солей кальцію в еритроцитах проводили в нативних мазках периферичної крові за допомогою спиртового розчину алізарину червоного S за методом Мак-Гі-Рассела [6]. Також визначали рівень загального та іонізованого кальцію в плазмі, рН крові за апаратним методом (Electrolytes Analyzer E-lyte 5, ELT‑1000).

Імунологічне дослідження апоптозу лейкоцитів (нейтрофільних гранулоцитів, моноцитів, лімфоцитів) проводилося за допомогою набору ApoLect для виявлення апоптотичних і некротично змінених клітин у зразках цільної крові (лабораторія кафедри імунології ЛНМУ імені Данила Галицького). Набір ApoLect містить манозоспецифічний лектин із нарциса Narcissus poeticus, що розпізнає олігоманозильні глікани ендоплазматичного ретикулуму, які експонуються на поверхні клітин при апоптозі і дають можливість виявляти апоптотичні клітини, а також барвник пропідій йодид (PI), що накопичується у клітинах із порушеною цілісністю плазматичної мембрани (тобто некротичних) і, зв’язуючись з ДНК, продукує сильний флуоресцентний сигнал. Принцип роботи набору ApoLect базується на виявленні специфічних гліканів, тому він придатний для визначення ядровмісних відмираючих клітин у цільній крові (після проведення лізису еритроцитів), що значно посилює чутливість детекції та підвищує точність аналізу результатів. Виявлення апоптотичних і некротичних клітин базується на детекції флуоресценції та може здійснюватись за допомогою флуоресцентного мікроскопа чи проточного цитометра, що дозволяє дискримінувати стандартні флуоресцентні мітки FITC та PI.

Ультраструктурні ознаки апоптозу лейкоцитів вивчали також за допомогою електронної мікроскопії у зразках крові цих же пацієнтів. Для цього натще з лiктьової вени брали 9 мл кровi у силікогенізовану пробірку. Кров змiшували у пробiрцi з 1% розчином цитрату натрiю у спiввiдношеннi 9 : 1 і центрифугували при 150 G протягом 10 хвилин до утворення осаду еритроцитiв. Надосадову частину кровi переносили у чисту пробiрку i центрифугували ще 10 хвилин. Отриманий осад білих клiтин крові у формі плівки промивали какодилатним буфером i переносили її у 2% розчині осмiю на 120 хв для фіксації в холодильники. Пiсля фіксації клiтини промивали в какодилатному буферi, а потiм зневоднювали у спиртових розчинах зростаючої концентрацiї (30, 50, 70, 90 %), а також у 100% ацетонi по 10 хв. Далi ці зразки кровi в формі плівки занурювали в сумiш епону та аральдиту, полiмеризували в желатинових капсулах за температури 60 °С. Ультратонкi зрiзи готували на ультрамiкротомi УМТП‑3 за допомогою скляних ножiв. Перед дослiдженням зрiзи клітин крові контрастували в цитратi свинцю за методом E. Reynolds. Отримані контрастованi зрiзи дослiджували за допомогою електронного мiкроскопа УЕМВ‑100-К і фотографували при збiльшеннi від 3000 до 12 000 разiв.

Для аналізу та порівняння отриманих результатів користувалися методами медичної статистики та програмним забезпеченням Statistica 6.0.

Результати

При проведенні імунологічних досліджень було виявлено вірогідне збільшення кількості апоптотично змінених ядерних клітин крові, переважно моноцитів, лімфоцитів і появу некротично змінених клітин крові у пацієнтів із ГКС і супутнім ЦД, а також за наявності професійно-зумовлених шкідливостей і шкідливих звичок (тютюнопаління).

Класичні ультраструктурні ознаки апоптозу лейкоцитів проявлялися їх надмірною осміофілією, конденсацією ядерного гетерохроматину, пікнозом і каріорексисом ядер, появою мікроміхурців у цитоплазмі клітин крові, вакуолізацією ендоплазматичної сітки та комплексу Гольджі, а також наявністю дрібних, округлої форми мітохондрій. Апоптоз лейкоцитів позитивно корелював із тяжкістю вказаних факторів ризику ІХС, а також з віком пацієнтів (рис. 1, 2).

При світловій мікроскопії мазків периферичної крові у пацієнта з дуже високим індексом кальцифікації вінцевих артерій (рис. 3) цитологічно спостерігається поява в еритроцитах гранул кальцію різної величини і форми, фіолетово-синього забарвлення, а також зміна їх форми і величини.

В окремих полях зору при цитологічному дослідженні препаратів крові пацієнтів з ГКС і тяжким або середньої тяжкості ЦД спостерігалося понад 90 % еритроцитів з депозитами солей кальцію (рис. 4), а в осіб із легким перебігом — до 50 % (рис. 5).

Наявність ЦД 2-го типу середнього або тяжкого ступеня, професійних шкідливостей, ожиріння і тютюнопаління значно збільшували ступінь кальцифікації як вінцевих судин, так і еритроцитів, а також лейкоцитів. У здорових осіб без факторів ризику ІХС депозитів кальцію в еритроцитах не спостерігалося.

При біохімічному дослідженні крові (електроліти плазми) спостерігалося зменшення рівня іонізованого кальцію в сироватці крові при зміщення рН у кислу сторону.

Обговорення

На сьогодні доведена важлива роль мітохондрій для багатьох, якщо не для всіх видів апоптозу [10]. У першу чергу це пов’язано з раптовою зміною проникності зовнішньої мембрани мітохондрій, яка запускає механізми загибелі клітини. Згідно з цією гіпотезою, першопричинну роль у клітинній загибелі шляхом апоптозу і некрозу відіграє зміна мітохондріальної проникності (mitochondrial permeability transition — МРТ), тобто раптове Са2+-залежне зростання проникності внутрішньої мітохондріальної мембрани для розчинів із молекулярною масою менше 1,5 кДа [18]. Це явище вперше було відкрито Д. Хантером зі співавт. (1976) [8]. Йому притаманна ключова роль в інтеграції та поширенні сигналів загибелі, що виникають в середині клітини (унаслідок руйнування ДНК, оксидативного стресу, голодування чи під впливом хіміотерапевтичних ліків) або надходять від рецепторів загибелі. Оскільки зміна мітохондріальної проникності відбувається як при апоптозі, так і при некрозі, існують фактори, що визначають шлях загибелі клітини. Одним із цих чинників є рівень АТФ у клітині, причому вирішальним може бути навіть не абсолютний вміст АТФ, а внутрішньоклітинне відношення АТФ/АДФ. Апоптоз відбувається за наявності певної кількості АТФ, а за її відсутності виникає некротична загибель клітини. У міру прогресування апоптозу АТФ може вичерпатися, тоді виникають ознаки вторинного некрозу апоптотично змінених клітин. Отже, ідентифікація апоптозу і некрозу в таких випадках стає утрудненою [18].

Останнє десятиріччя ознаменувалося кардинальною трансформацією уявлень про нейтрофільні гранулоцити [19]. Якщо спочатку нейтрофіли розглядались винятково як клітини-мікрофаги, а також «авангард лейкоцитів», що першими вступають у боротьбу із збудником у вогнищі запалення (короткоживучі, неспецифічні, здатні тільки до фагоцитозу або екзоцитозу клітини; ті, що можуть бути кілерами своїх ушкоджених тканин), то сучасні дані характеризують їх як специфічну зброю, що швидко мобілізується та безпосередньо залучена до процесів активації ендотелію, моноцитів, макрофагів, тромбоцитів, дендритних клітин і Т-лімфоцитів. Іншими словами, нейтрофіли — це головні менеджери імунного захисту, які реагують на будь-які метаболічно-обмінні та альтеративні процеси, що відбуваються в організмі [7]. На думку деяких авторів, оцінка функціональної активності системи нейтрофільних гранулоцитів шляхом проведення цитоморфометричних досліджень із застосуванням автоматизованих апаратних методів, дозволяє прогнозувати перебіг низки тяжких захворювань та інтоксикацій [5]. Метод заснований на зміні оптичної прозорості клітин в активованому стані, в стані функціонального спокою, а також при розвитку необоротних процесів некробіозу чи апоптозу через дію на них різних ушкоджуючих факторів. Відкладання депозитів внутрішньоклітинного кальцію в лейкоцитах, що передує запуску процесів апоптозу цих клітин та виявляється при світловій мікроскопії з використанням специфічних для даного іона способів забарвлення або ж при електронній мікроскопії, також впливає на оптичну прозорість досліджуваних клітин, а тому поєднання цих двох методів, на нашу думку, матиме перспективне значення.

Загибель еритроцитів характеризується деякими особливостями, що не притаманні процесу апоптозу ядерних клітин [14]. Деякі автори для характеристики процесу апоптозу в еритроцитах пропонують вживати термін «eryptosis» (Ланг К.С. і співавт., 2005). Добре відомо, що форма й еластичність еритроцитів значно залежать від іонів кальцію: збільшення вмісту внутрішньоклітинного Ca2+ призводить до змін їх форми та об’єму, підвищення клітинної жорсткості й схильності до гемолізу. Eриптозис може бути викликаний енергодефіцитом, осмотичним шоком або окислювальним стресом [13]. Енергодефіцит (зниження активності помпи Ca2+-АТФази) призводить до входу кальцію у клітини, що, в свою чергу, прискорює трансмембранний рух калію та хлориду з подальшою дегідратацією клітини. Енергодефіцит разом зі зниженням запасів глутатіону також послаблює антиоксидантний захист еритроцитів, що аналогічним чином активує трансмембранні катіонні канали, посилюючи потік кальцію в середину клітини. Атерогенні та біохімічні зміни в крові при ІХС, а саме порушення ліпідного обміну з подальшою активацією перекисного окиснення ліпідів, гіперпероксидація й оксидативний стрес з утворенням вільних радикалів [9] призводять до переходу оксигемоглобіну в метгемоглобін, підвищення активності протеаз, каспаз, екстерналізації фосфатидилсерину, збільшення вмісту внутрішньоклітинного кальцію, а в подальшому — до ініціації процесів апоптозу та порушення структури і функції еритроцитів [17].

Отже, наведені дані свідчать про складність та універсальність механізмів апоптозу різних клітин організму, що виникають під впливом різноманітних патофізіологічних процесів, до яких належать і фактори ризику ІХС. З огляду на роль лейкоцитів як ключових реалізаторів клітинного та гуморального імунітету в організмі людини, а також еритроцитів як найбільшої популяції формених елементів крові та основних переносників газів крові особливого значення набуває дослідження саме цих клітин для оцінки впливу різних факторів ризику на виникнення та прогресування ІХС. Визначення рівня іонізованого кальцію плазми крові та виявлення депозитів кальцію в еритроцитах шляхом оптичної мікроскопії є недорогим і надійним індикатором активації процесів апоптозу клітин під впливом різних факторів ризику ІХС.

Висновки

1. Наявність у пацієнтів з ІХС старшого і похилого віку таких факторів ризику, як цукровий діабет 2-го типу, артеріальна гіпертензія, атерогенна дисліпідемія, а також ожиріння, тютюнопаління та професійні шкідливості, призводить до активації процесів апоптозу лейкоцитів, зокрема нейтрофільних гранулоцитів і моноцитів/макрофагів. Їх можна виявити за допомогою сучасних специфічних імунологічних тестів, а також електронно-мікроскопічних досліджень.

2. Високий (400–999 од.) і дуже високий (понад 1000 од.) індекс кальцифікації коронарних артерій асоціюється з кальцифікацією переважної більшості еритроцитів, апоптозом і кальцифікацією значного відсотка лейкоцитів периферичної крові, що корелює з наявністю та тяжкістю ІХС.

3. Виявлена асоціація між кальцифікацією еритроцитів і лейкоцитів та індексом кальцифікації коронарних артерій є маркером прогресування ІХС та може полегшити пошук профілактичних і лікувальних засобів для оптимізації лікування цього контингенту пацієнтів.

Конфлікт інтересів. Автори гарантують відсутність конфлікту інтересів і власної фінансової зацікавленості при виконанні роботи та написанні статті.

Список литературы

1. Біохімічні механізми апоптозу: Навчальний посібник/ Л.І. Остапченко, Т.Б. Синельник, Т.В. Рибальченко, В.К. Рибальченко. — К.: Видавничо-поліграфічний центр «Київський університет», 2010. — С. 8-9.

2. Гандзюк В.А. Аналіз захворюваності на ішемічну хворобу серця в Україні / В.А. Гандзюк // Український кардіологічний журнал. — 2014. — № 3. — С. 45-52.

3. Діагностика ураження коронарних артерій у хворих на ішемічну хворобу серця за допомогою мультизрізової комп’ютерної томографії / О.С. Никоненко, А.О. Никоненко, Б.С. Гавриленко, А.І. Лозовий // Запорізький медичний журнал. — 2015. — № 1(88). — С. 4-8.

4. Колісник Н.В. Біологія нейтрофілів, сучасний погляд. Огляд / Н.В. Колісник, Ж.С. Качанова // Вісник Запорізького національного університету. — 2009. — № 1.

5. Стан системи нейтрофільних гранулоцитів як чинник ризику післяопераційних ускладнень при аневризмах черевної аорти / І.В. Гомоляко, П.І. Нікульніков, О.В. Ліскунов [та ін.] // Серце і судини. — 2015. — № 3. — С. 80-85.

6. Целуйко С.С. Предполагаемые механизмы гистохимического исследования кальция, железа, натрия, цинка др. и витаминов в организме: Метод. рекомендации / С.С. Целуйко, С.В. Зиновьев. — ГБОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия, г. Благовещенск, 2013. — С. 17.

7. Associations between C-reactive protein, coronary arterycalcium, and cardiovascular events: Implications for the JUPITER population from MESA, a population-based cohort study / M.J. Blaha, M.J. Budoff, A.P. DeFilippis [et al.] // Lancet. — 2011. — Vol. 378. — Р. 684-692.

8. Coronary artery calcification is an independent stroke predictor in the general population / D.M. Hermann, J. Gronewold, N. Lehmann [et al.] // Stroke. — 2013. — Vol. 44. — Р. 1008-1013.

9. Coronary artery calcium score and risk classification for coronary heart diseaseprediction / T.S. Polonsky, R.L. McClelland, N.W. Jorgensen [et al.] // JAMA. — 2010. — Vol. 303. — Р. 1610-1016.

10. Coronary calcium score improves classification of coronary heart disease risk in the elderly: The Rotterdam study / S.E. Elias-Smale, R.V. Proenca, M.T. Koller [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. — 2010. — Vol. 56. — Р. 1407-1414.

11. Effect of high glucose concentrations on human erythrocytes in vitro / Jana Viskupicova, Dusan Blaskovic, Sabina Galiniak [et al.] // Redox Biology. — 2015. — Vol. 5. — Р. 381-387.

12. Erythrocyte: Programmed Cell Death, Anemia. Donald Silverberg, Daniela Vittori, Daiana Vota, Alcira Nesse (Ed.). — 2012. — Available from: http://www.intechopen.com/books/anemia/erythrocyte-programmed-cell-death

13. Family history of coronary heart disease and the incidence and progression of coronary artery calcification: Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis (MESA) / A.K. Pandey, M.J. Blaha, K. Sharma [et al.] // Atherosclerosis. — 2014. — Vol. 232. — Р. 369-376.

14. Increased cation conductance in human erythrocytes artificially aged by glycation / Y.V. Kucherenko, S.K. Bhavsar, V.I. Grischenko [et al.] // J. Membr. Biol. — 2010. — Vol. 235. — Р. 177-189.

15. Kumar R. Biochemical changes in erythrocyte membrane in type 2 diabetes mellitus / R. Kumar // Indian J. Med. Sci. — 2012. — Vol. 66. — Р. 131-135.

16. Manno S. ATP-dependent mechanism protects spectrin against glycation in human erythrocytes / S. Manno, N. Mohandas, Y. Takakuwa // J. Biol. Chem. — 2010. — Vol. 285. — Р. 33923-33929.

17. Oxidative damage increases intracellular free calcium [Ca2+] concentration in human erythrocytes incubated with lead / M.A. Quintanar-Escorza, M.T. Gonzalez-Martinez, M.P. Intriago-Ortega, J.V. Calderon-Salinas // Toxicol. іn Vitro. — 2010. — Vol. 24. — Р. 1338-1346.

18. Prediction of coronary artery calcium progression in individuals with low Framingham Risk Score: The Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis / T.M. Okwuosa, P. Greenland, G.L. Burke [et al.] // JACC Cardiovasc. Imaging. — 2012. — Vol. 5. — Р. 144-153.

19. Relation of the contractile reserve of hibernating myocardial structure in humans / S.F. Nagueh, I. Mikati, D. Weilbaecher [et al.] // Circulation. — 1999. — Vol. 98, Suppl. — P. 490-496.