Мобильная версия

Журнал «Здоровье ребенка» Том 12, №8, 2017

До питання вітамін-D-залежної регуляції локальних механізмів неспецифічного захисту в дітей із дисплазією сполучної тканини

Авторы: Омельченко Л.І.(1), Муквіч О.М.(1), Лавренчук О.В.(2)
(1) — ДУ «Інститут педіатрії, акушерства і гінекології НАМН України», м. Київ, Україна
(2) — КНП «Центр первинної медико-санітарної допомоги № 1» Шевченківского району, м. Київ, Україна

Рубрики: Педиатрия/Неонатология

Разделы: Справочник специалиста

Проведено визначення показників неспецифічного імунітету (людський β-дефензин 2 (HBD-2), лізоцим) у локальних секретах (слина, копрофільтрат) 127 дітей віком 11–17 років із фенотиповими проявами дисплазії сполучної тканини (ДСТ) з урахуванням забезпеченості вітаміном D. Найбільш низькі концентрації HBD-2 встановлені в дітей із ДСТ при дефіциті вітаміну D (ДВD), що свідчить про вітамін-D-залежну регуляцію продукції антимікробних пептидів в епітеліоцитах слизової оболонки кишечника. Констатовано недостатність неспецифічної гуморальної імунної відповіді (зниження лізоциму в слині та копрофільтратах) при ДВD у дітей із ДСТ та пряму залежність між концентраціями 25ОНD та лізоциму (r = 0,65), що опосередковано свідчить про вроджену недостатність синтезу або більш інтенсивне виснаження захисних функцій слизових при порушенні синтезу колагену в базальних мембранах дітей з ДСТ та підтверджує залежність концентрації лізоциму від забезпеченості вітаміном D.

Проведено определение показателей неспецифического иммунитета (человеческий β-дефензин 2 (HBD-2), лизоцим) в локальных секретах (слюна, копрофильтрат) 127 детей в возрасте 11–17 лет с фенотипичными проявлениями дисплазии соединительной ткани (ДСТ) с учетом обеспеченности витамином D. Наиболее низкая концентрация HBD-2 выявлена у детей с ДСТ при дефиците витамина D (ДВD), что свидетельствует о витамин-D-зависимой регуляции продукции антимикробных пептидов в эпителиоцитах слизистой оболочки кишечника. Констатирована недостаточность неспецифического гуморального иммунного ответа (снижение лизоцима в слюне и копрофильтратах) при ДВD у детей с ДСТ и прямая зависимость между концентрациями 25ОНD и лизоцимом (r = 0,65), что косвенно свидетельствует о врожденной недостаточности синтеза или более интенсивном истощении защитных функций слизистой оболочки при нарушении синтеза коллагена в базальных мембранах детей с ДСТ и подтверждает зависимость концентрации лизоцима от обеспеченности ВД.

Parameters of non-specific immunity (human β-defensin 2 (HBD-2), lysozyme) were evaluated in local secretions of 127 children aged 11–17 years with phenotypic connective tissue dysplasia (CTD), with respect to the vitamin D supplementation. The lowest concentration of HBD-2 in local secretion was found in children with CTD and vitamin D deficiency (VDD) that is an indication of the vitamin D-dependent regulation of anti-microbal peptide production in epitheliocytes of the intestinal mucosa. The VDD is accompanied by the deficiency of non-specific humoral immune response (decreased lysozyme in saliva and coprofiltrate) in children with CTD. The deficiency is in direct dependency with vitamin D concentration and lysozyme (r = 0.65) that indicates the congenital insufficiency of synthesis or increased depletion of defense mucosal function in children with impaired collagen synthesis in basal membranes confirming that lysozyme concentration depends on the vitamin D supplementation.

Ключевые слова

вітамін D; дисплазія сполучної тканини; антимікробні пептиди; діти

витамин D; дисплазия соединительной ткани; антимикробные пептиды; дети

vitamin D; connective tissue dysplasia; antimicrobial peptides; children

doi: http://dx.doi.org/10.22141/2224-0551.12.8.2017.119244

Вступ

Імунна відповідь в організмі дитини залежить від злагодженого функціонування як вроджених неспецифічних механізмів захисту (бар’єрні функції слизових оболонок, гуморальні неспецифічні чинники місцевого захисту, функціонування системи комплементу, моноцитарно-макрофагальна активність імунокомпетентних клітин, тощо), так і набутої специфічної (адаптивної) ланки імунітету [3].

Результати сучасних наукових досліджень свідчать, що недостатня забезпеченість вітаміном D (ВD), характерна для основної маси населення, є чинником ризику не тільки остеопорозу, а й автоімунних, онкологічних, серцево-судинних, інфекційних, неопластичних процесів, цукрового діабету тощо, що опосередковано підтверджується наявністю рецепторів до ВD (VDR) у багатьох органах і тканинах, у тому числі в клітинах імунної системи [1, 9]. Доведено, що прямо чи опосередковано обмін ВD в організмі регулюється більше ніж 200 видами генів, у тому числі тими, які відповідають за проліферацію, диференціювання клітин, апоптоз і ангіогенез [5].

Відносно нещодавнім надбанням еволюційного розвитку живих організмів є ВD-залежна регуляція неспецифічних механізмів захисту. Найважливішими імуномодулюючими ефектами ВD є індукція диференціювання моноцитів, стимуляція процесів фагоцитозу в макрофагах, посилення продукції антимікробних пептидів (АМП). Встановлено, що поєднана експресія фактора транскрипції сукупності стероїд-гормональних рецепторів ВD та мітохондріального ферменту родини цитохрому Р450 1α-гідроксилази відмічається в моноцитах, дендритних клітинах, лімфоцитах, нейтрофілах, епітеліоцитах респіраторного й харчового трактів, клітин децидуальної оболонки й трофобластах [4].

Активація експресії екстраренальної 1α-гідро–ксилази в кістковій тканині, епітелії шкіри, слизових оболонках легенів і кишечника, паращитоподібних залоз забезпечує синтез кальцитріолу, що взаємодіє з VDR, індукуючи продукцію антимікробних пептидів [7]. Індукція експресії екстраренальної 1α-гідроксилази асоційована зі збудженням Toll-подібних рецепторів (ТLR, NLR) і дією TGF-β1. Наявність ВD сприяє продукції АМП-кателіцидину (LL-37) при збудженні ТLR1/2. Доведено, що при активації ТLR кальцитріол індукує синтез β-дефензинів і кателіцидину (LL-37) не тільки в моноцитах, але й у нейтрофілах і кератиноцитах. При цьому в клітинах імунної системи підвищення експресії АМП, що спостерігається при стимуляції ТLR у присутності ВD, супроводжується одночасним пригніченням продукції прозапальних Тh₁-асоційованих цитокінів ІL-1, ІL-12 і TNF-α [6].

Встановлено, що Тh₁- і Тh₂-асоційовані цитокіни диференційовано впливають на продукцію АМП. Основними цитокінами, що регулюють ТLR2/1-асоційовану індукцію експресії АМП кателіцидину та людського β-дефензиму 2 (HBD-2), є ІFN-γ та ІL-4. У відповідь на стимуляцію ІFN-γ людські макрофаги синтезують 1,25(ОН)₂D, і при достатній експресії VDR виникає активація продукції АМП моноцитами й макрофагами [8, 12]. Взаємодія VDR із VDRЕ обумовлює індукцію синтезу НВD-2 і кателіцидину (LL-37), а кальцитріол індукує експресію й НВD-3. Для експресії НВD-2, НВD-3 необхідна конвергенція збудження ТLR і впливу ІL-1β, а в ентероцитах індукція їх експресії може бути пов’язана з активацією NLRC2 [11].

Треба зазначити, що численні типи клітин людського організму експресують VDR і 1α-гідро–ксилазу, але дані молекулярно-біологічних досліджень показують, що VDR-опосередкована індукція АМП не є універсальною для всіх типів клітин організму і в природних умовах залежить від багатьох різних зовнішніх і внутрішніх факторів. VDR-опосередкована індукція АМП є характерною особливістю мієлоїдних клітин, кератиноцитів, трофобластів, епітеліоцитів харчового й респіраторного тракту. Епітеліоцити слизової оболонки товстого кишечника беруть активну участь у VDR-опосередкованій індукції АМП. ВD-залежна регуляція продукції АМП в епітеліоцитах товстого кишечника, що регулярно взаємодіють з коменсальними кишковими бактеріями, мають суттєву відмінність від VDR-опосередкованої індукції АМП моноцитами, кератиноцитами й іншими клітинами. Продемонстровано, що кальцитріол-асоційований сигнальний шлях продукції АМП функціонально пов’язаний з цитоплазматичним NOD-подібним рецептором — NLRС2, збудження якого мурамілдипептидом при адекватному забезпеченні кальцитріолом сприяє збільшенню (практично в два рази) продукції НВD-2 і кателіцидину (LL-37) епітеліоцитами слизової кишечника [10].

Вплив плейотропних активних метаболітів ВD на реакцію захисних неспецифічних механізмів локальних секретів, що обумовлює активність бар’єрних функцій слизових оболонок, може мати особливе значення в дітей із дезорганізацією базальних мембран при дисплазії сполучної тканини (ДСТ), оскільки відома схильність дітей до захворювань шлунково-кишкового тракту та респіраторної патології.

Мета: визначити концентрацію HBD-2 і лізоциму в локальних секретах у дітей із ДСТ з урахуванням забезпеченості організму вітаміном D.

Матеріали та методи

Проведено дослідження показників неспецифічного імунітету (HBD-2 і лізоциму) в слині та копрофільтратах (КФ) у 127 дітей 11–17 років. Залежно від ступеня вираженості фенотипових проявів ДСТ за кількістю балів відповідно до класифікації Т. Мілковської-Дімітрової в модифікації Л.Н. Абакумової [2] виділяли: легкий ступінь дисплазії (варіант норми) — загальна кількість балів до 12, помірний — 13–23 бали та виражений ступінь дисплазії — 24 бали й більше. Статус вітаміну D оцінювали за останньою класифікацією, згідно з якою дефіцит вітаміну D (ДВD) встановлюється при рівні 25ОНD нижче від 50 нмоль/л, недостатність ВD — при показниках 25ОНD між 50 та 75 нмоль/л, а концентрація 25ОНD у межах 75–125 нмоль/л вважається нормальною [11]. Використовували імуноферментні набори для кількісного визначення 25-гідроксивітаміну D та інших гідроксильованих метаболітів у сироватці або плазмі виробництва Immunodiagnostic Systems Ltd (IDS Ltd) (Велика Британія).

З урахуванням концентрації ВD у сироватці крові визначено 4 групи дітей: 1-ша група — здорові діти з фізіологічним рівнем 25ОНD, 2-га група — діти з помірними та вираженими ступенями ДСТ та з фізіологічними концентраціями ВD (75–100 нмоль/л), 3-тя група — діти з ДСТ та недостатністю 25ОНD (50–75 нмоль/л), 4-та група — діти з ДСТ та дефіцитом вітаміну D (нижче від 50 нмоль/л).

У виділених групах проаналізовано концентрацію HBD-2 та лізоциму в локальних секретах (слина, копрофільтрат). Концентрацію дефензинів (HBD-2) визначали методом імуноферментного аналізу з використанням комерційного набору β-Defensin 2 ELISA Kit, виробник Immundiagnostik AG, Німеччина. Концентрацію лізоциму в слині та копрофільтратах — за методикою з використанням сухого порошку одноденної культури Micrococcus lyzodeiticus.

Результати та обговорення

При дослідженні антимікробних пептидів, зокрема HBD-2, у слині найбільш високі його концентрації виявлені в здорових дітей 1-ї групи, що мали фізіологічну концентрацію 25ОНD

4,52 ± 0,06 нг/мл. У дітей із диспластичними проявами (2-га та 3-тя групи) зареєстровані більш низькі концентрації HBD-2, а в дітей із ДСТ та ДВD показники були найменшими серед обстежених осіб — 3,88 ± 0,08 нг/мл (табл. 1).

Згідно з Т-тестом Welch, з 95% вірогідністю, що відповідає p-значенням в інтервалі 0 ≤ p ≤ 0,05, статистично вірогідні різниці спостерігалися: між 1-ю та 4-ю групами (p_{1, 4} = 2,97 • 10^–8); між 2-ю та 4-ю групами (p_{2, 4} = 0,05); між 1-ю та 2-ю групами (p1, 2 = 0,05); між 3-ю та 4-ю групами (p_{3, 4} = 0,04).

При дослідженні HBD-2 у копрофільтратах найбільш високі показники HBD-2 виявлені в 1-й групі — 81,14 ± 5,13 нг/мл (табл. 2). У групах дітей із диспластичними проявами відмічається вірогідна різниця даних (р ≤ 0,05) залежно від концентрації 25ОНD, при цьому найменші концентрації виявлені в групі з ДВD — 52,63 ± 3,01 нг/мл.

Згідно з Т-тестом Welch, з 95% вірогідністю, що відповідає p-значенням в інтервалі 0 ≤ р ≤ 0,05, статистично вірогідні різниці спостерігалися: між 1-ю та 4-ю групами (p_{1, 4} = 1,43 • 10^–5); між 2-ю та 4-ю групами (p_{2, 4} = 0,001); між 1-ю та 2-ю групами (p1, 2 = 0,05); між 3-ю та 4-ю групами (p_{3, 4} = 0,05).

Отже, вірогідна різниця показників HBD-2 у слині та КФ дітей 1-ї та 2-ї груп свідчить про більш низькі концентрації АМП у дітей із ДСТ, навіть без недостатності ВD, що опосередковано може визначати вроджену недостатність синтезу або свідчити про більш інтенсивне виснаження захисних функцій слизової оболонки в пацієнтів із дезорганізацією сполучної тканини, яка є обтяжуючим фактором щодо формування та перебігу диспластикозалежних патологічних процесів у такої категорії дітей. Більш низькі концентрації HBD-2, як компонента неспецифічного захисту слизових оболонок, що проявляється однаковою мірою при дослідженні як слини, так і копрофільтратів, у дітей з D-дефіцитом можуть свідчити про вітамін-D-залежну регуляцію продукції АМП в епітеліоцитах слизової оболонки товстого кишечника, які регулярно взаємодіють з мікробіотою кишечника.

Концентрація лізоциму як фактора неспецифічного гуморального імунного захисту в локальних секретах є вірогідним імунологічним маркером функціонального стану організму, показником резистентності, що відображає стан його імунологічної реактивності, активність запального процесу та прогноз захворювання. Результати визначення концентрації лізоциму в слині та КФ у пацієнтів дослідних груп подано в табл. 3.

За T-тестом Welch з рівнем значущості α = 0,05 спостерігається така картина відмінностей за концентрацією лізоциму в слині: між 1-ю та 4-ю групами (p_{1, 4} = 3,78 • 10^–5); між 2-ю та 4-ю групами (р2, 4 = 1,58 • 10^–6); між 3-ю та 4-ю групами (р3, 4 = 0,05). Проте статистично вірогідна різниця відсутня між 1-ю, 2-ю та 3-ю групами (р1, 2 = 0,12; p1, 3 = 0,07; p2, 3 = 0,56).

У КФ залежність синтезу лізоциму в групах простежується більш чітко (табл. 3). Найвищі показники мали діти 1-ї (4,68 ± 0,10 мг/л) та 2-ї (4,41 ± 0,09 мг/л) груп, що відображає адекватність синтезу ендогенного лізоциму клітинами слизової оболонки кишечника здорових дітей. Проте найбільш низька концентрація лізоциму виявлена в дітей із ДСТ та ДВD — 4,09 ± 0,08 мг/л.

Згідно з T-тестом Welch з рівнем значущості α = 0,05 спостерігаються відмінності між 1-ю та 4-ю групами (p_{1, 4} = 2,15 • 10^–5); між 2-ю та 4-ю групами (p_{2, 4} = 0,04). При цьому між 3-ю та 4-ю групами вірогідної різниці не виявлено (p_{3, 4} = 0,7).

Отже, при фізіологічних концентраціях 25ОНD як у дітей із ДСТ, так і в здорових дітей без фенотипових ознак дисплазії сполучної тканини показники лізоциму в локальних секретах (слина, копрофільтрат) вірогідно відрізнялись від його значень у дітей із ДСТ та дефіцитом вітаміну D. При цьому визначається пряма залежність між концентраціями вітаміну D та лізоциму (r = 0,65), що підтверджує залежність концентрації лізоциму від забезпеченості організму 25ОНD. Зниження вмісту 25ОНD призводить до зменшення рівня лізоциму в слині та КФ дітей із ДСТ, що визначає недостатність неспецифічної гуморальної імунної відповіді, яка може бути пов’язана з первинним дефектом мікромакрофагальної ланки імунологічного захисту організму, збільшенням лімфоплазмоцитарної й гранулоцитарної інфільтрації в місцях запалення або зміною її відповіді на антигени різного походження. Отримані результати певною мірою можуть пояснити схильність дітей із ДСТ до частих вірусно-бактеріальних захворювань із формуванням хронічних запальних процесів у носоглотці, шлунку та кишечнику.

Вираженість порушень продукції АМП та лізоциму в дітей із ДВD обумовлює доцільність проведення його корекції, що може підвищити рівень захисних функцій слизових оболонок і сприяти зменшенню захворюваності на респіраторну та шлунково-кишкову патологію.

Висновки

1. У дітей з ДСТ встановлено зменшення концентрації HBD-2 у локальних секретах порівняно зі здоровими дітьми без ознак ДСТ, що опосередковано може визначати вроджену недостатність синтезу або більш інтенсивне виснаження захисних функцій слизової оболонки при дезорганізації сполучної тканини та порушенні синтезу колагену в базальних мембранах, що є обтяжуючим фактором перебігу патологічних процесів у такої категорії дітей.

Низькі концентрації HBD-2, як компонента неспецифічного захисту слизових оболонок, що проявляється однаковою мірою при дослідженні як слини, так і копрофільтратів, у дітей з D-дефіцитом свідчить про вітамін-D-залежну регуляцію продукції HBD-2 в епітеліоцитах слизової оболонці кишечника.

2. Концентрація лізоциму в локальних секретах при фізіологічних концентраціях 25ОНD як у дітей із ДСТ, так і здорових дітей вірогідно відрізнялись від показників дітей із ДСТ на тлі дефіциту вітаміну D. Визначена пряма залежність між концентраціями вітаміну D та лізоциму (r = 0,65), що підтверджує залежність концентрації лізоциму від забезпеченості організму 25ОНD та визначає недостатність неспецифічної гуморальної імунної відповіді, яка може бути пов’язана з первинним дефектом мікромакрофагальної ланки імунологічного захисту організму або пригніченням її активності в місцях запалення. Вираженість порушень продукції АМП та лізоциму в дітей з ДСТ та ДВD обумовлює доцільність проведення корекції вітаміну D у такої категорії дітей.

Конфлікт інтересів. Автори заявляють про відсутність конфлікту інтересів при підготовці даної статті.

Список литературы

1. Абатуров А.Е. Лечение и профилактика недостаточности и дефицита витамина D у детей и подростков / А.Е. Абатуров, Т.П. Борисова, Е.Л. Кривуша // Здоровье ребенка. — 2015. — № 3(63). — С. 73-78.

2. Аббакумова Л.Н. Клинические формы дисплазии соединительной ткани у детей: учеб. пособие / Л.Н. Аббакумова. — СПб.: СПбГПМА, 2006. — 46 с.

3. Драник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология: пособие для студентов, врачей-интернов, иммунологов, аллергологов, врачей лечебного профиля всех специальностей / под ред. Г.Н. Драник. — 4-е изд. — К. 2010. — 552 с.

4. Hewison M. Vitamin D and innate and adaptive immunity / M. Hewison // Vitam. Horm. — 2011. — Vol. 86. — Р. 23-62.

5. Chatterjee M. Vitamin D and genomic stability / M. Chatterjee // Mutat. Res. — 2001. — Vol. 86, № 2. — P. 69-87.

6. Injury enhances TLR2 function and antimicrobial peptide expression through a vitamin D-dependent mechanism / J. Schauber, R.A. Dorschner [et al.] // J. Clin. Invest. — 2007. — Vol. 117, Issue 3. — P. 803-811.

7. Gombart A.F. The vitamin D-antimicrobial peptide pathway and its role in protection against infection / Gombart A.F. // Future Microbiol. — 2009. — Vol. 4, № 9. — Р. 1151-1165.

8. Gombart A.F. Human cathelicidin antimicrobial peptide (CAMP) gene is a direct target of the vitamin D receptor and is strongly up-regulated in myeloid cells by 1,25-dihydroxyvitamin D / A.F. Gombart, N. Borregaard, H.P. Koeffler // Тhe FASEB Journal. — 2005. — Vol. 19, № 9. — Р. 1067-1077.

9. Hartley M. Comparing the effects of sun exposure and vitamin D supplementation on vitamin D insufficiency, and immune and cardio-metabolic function: the Sun Exposure and Vitamin D Supplementation (SEDS) Study / M. Hartley, S. Hoare, F. Lithander, E. Rachel // Neale BMC Public Health. — 2015. — Vol. 15. — Р. 115-119.

10. Vitamin D deficiency in mice impairs colonic antibacterial activity and predisposes to colitis / V. Lagishetty, A.V. Misharin, N.Q. Liu [et al.] // Endocrinology. — 2010. — Vol. 151, № 6. — Р. 2423-2432.

11. Vitamin D Induction of the Human Antimicrobial Peptide Cathelicidin in the Urinary Bladder / O. Hertting, Å. Holm, P. Lüthje, H. Brauner // PLoS One. — 2010. — Vol. 5, № 12. — P. 97-105.

12. 25-dihydroxyvitamin D3 induces CCR10 expression in terminally differentiating human B cells / A.K. Shirakawa, D. Nagakubo, K. Hieshima [et all.] // J. Immunol. — 2008. — Vol. 180. № 5. — Р. 2786-2795.