Журнал «Здоровье ребенка» Том 12, №8, 2017

Бактерии с мультилекарственной резистентностью (multidrug-resistant — MDR), экстенсивной лекарственной резистентностью (extensively drug-resistant — XDR) представляют реальную угрозу человечеству практически во всех странах мира [17, 28]. Ускорение прироста уровня распространенности антибиотикорезистентности клинически значимых бактериальных штаммов привело к интенсификации исследований, направленных на поиск и разработку новых антимикробных лекарственных средств, в том числе основанных на молекулярных структурах эндолизинов, бактериоцинов, антимикробных пептидов (АМП); созданию препаратов моноклональных антител, направленных против бактериальных факторов вирулентности, пробио–тиков и вакцин [10]. Натуральные АМП впервые были открыты в 1939 году René J. Dubos [12], который экстрагировал из бактерии Bacillus brevi грамицидин, обладающий высокой бактерицидной активностью против широкого спектра грамположительных бактерий. Однако понимание функционирования АМП как универсального оружия иммунной системы против патогенных микроорганизмов привнесли Hans G. Boman и соавторы в 70-х годах прошлого века [47]. Hans G. Boman задал простой вопрос: при помощи каких механизмов защиты мы остаемся здоровыми, если подготовка к продукции специфических антител занимает недели, в то время как микроорганизмы делятся ежечасно? В 1972 году была идентифицирована индуцибельная продукция антимикробного пептида у дрозофилы, который в 1981 году был охарактеризован и получил название цикропина. Несмотря на то, что вначале продукцию АМП считали ответом, специфическим для насекомых, в последующем была показана глобальная роль АПМ в противоинфекционной защите практически всех существующих организмов [14]. Антимикробные пептиды представляют собой древнейший неспецифический механизм защиты организма от разнообразных инфекционных патогенов, в том числе бактерий, вирусов, грибов [37, 46]. С момента открытия первого антимикробного пептида до настоящего времени присутствие АМП обнаружено у всех организмов: гены АМП идентифицированы в геномах как у прокариот, так и у млекопитающих [41]. Антимикробные пептиды обладают чрезвычайным структурным и функциональным разнообразием: они проявляют не только антибактерицидное, но и иммуномодулирующее действие, а также оказывают влияние на ангиогенез, репарацию тканей, развитие воспалительной реакции и др. [15, 42, 44, 46]. Установлено, что некоторые АМП благодаря быстрой реакции механизмов их синтеза на внедрение патогена и широкому спектру бактерицидности пептидов обладают более высоким уровнем противомикробной активности, чем обычные антибиотики [26]. На основании молекул АМП уже созданы и разрабатываются новые антибактериальные средства, которые вызывают гибель бактерии гораздо эффективнее, чем обычные антибиотики (табл. 1) [27, 30, 43, 56, 57]. Первое терапевтическое использование АМП было проведено в 2009 году [27]. 

Большинство молекул АМП представляют собой относительно короткие, состоящие из 10–50 аминокислотных остатков, амфифильные пептиды с общим положительным зарядом от +2 до +11. В зависимости от особенностей вторичной структуры молекул АМП классифицируются: на α-спирали, β-листы, пептиды со случайной структурой спирали, цистеинстабилизированные α-β мотивы (рис. 1) [29, 32]. 

Большинство АМП представляют α-спирали, β-листы. Антимикробные пептиды с α-спиральной структурой у человека представлены: LL-37, неактивным предшественником которого является кателицидин (hCAP18), продуцируемый нейтрофилами и эпителиальными клетками [62], и лактоферрицином, предшественником которого является гликопротеин лактоферрин, присутствующий в экскретах экзокринных желез [63]. Антимикробные пептиды с β-листовой структурой стабилизированы дисульфидными связями и при взаимодействии с мембраной не испытывают резкое конформационное изменение, как α-спиральные пептиды. Наиболее изученными пептидами данного класса АМП являются дефензины, продуцируемые как неактивные предшественники нейтрофилами, макрофагами и эпителиальными клетками [58].

Общая база данных АМП представляет собой коллекцию 19 062 аминокислотных последовательностей, обладающих бактерицидной активностью против различных микроорганизмов. Электронные адреса баз данных АМП представлены в табл. 2 [33].

Антимикробные пептиды продуцируются при помощи рибосомной трансляции мРНК или нерибосомного пептидного синтеза. Рибосомно-синтезируемые АМП продуцируются всеми видами организмов, включая бактерии, а нерибосомный синтез АМП преимущественно характерен для бактерий. По сравнению с пептидами нерибосомного происхождения, многие из которых уже продолжительное время используются в клинической практике в качестве антибиотиков (например, полимиксины и грамицидин S), терапевтический потенциал рибосомно-синтезируемых АМП признан только в последнее время. У млекопитающих АМП в основном продуцируются нейтрофилами и эпителиальными клетками слизистых оболочек и кожи. В разных компартментах человеческого организма продуцируется своеобразный спектр АМП (рис. 2) [36]. 

Характеристика антимикробных пептидов ткани легкого человека представлена в табл. 3.

Гены некоторых АМП в геноме человека располагаются кластерами и коэкспрессируются, что приводит к накоплению разнообразных AMP на территории одного сайта. Большинство АМП продуцируются как неактивные молекулярные предшественники пептида, которые для своей активации требуют протеолитического расщепления. У многоклеточных организмов некоторые AMP конститутивно экспрессируются в виде неактивных предшественников и сохраняются в гранулах, высвобождаясь исключительно в местах инфицирования; другие же AMP продуцируются в ответ на стимуляцию цитокинами или сигналами, ассоциированными с образраспознающими рецепторами [36].

Положительный заряд АМП обеспечивает более высокую вероятность их взаимодействия с отрицательно заряженными клеточными стенками бактерий, чем с нейтральными клеточными мембранами клеток макроорганизма. Важно отметить, что АМП остаются бактерицидно активными по отношению к антибиотикорезистентным микробам [38, 64]. Антимикробные пептиды, взаимодействуя с бактериями, приводят к деструкции бактериальной стенки за счет трех основных способов нарушения целостности: образуя цилиндрические или торо–идальные поры или разрывая внутреннюю мембрану бактериальной стенки («ковровая» модель) (рис. 3, табл. 4). 

Необходимо отметить, что АМП взаимодействуют с бактериальными мембранами при относительно низких своих концентрациях, в то время как при высокой концентрации они могут взаимодействовать с эритроцитами, гликопротеины мембран которых содержат сиаловую кислоту, и вызывать гемолиз [59].

Большинство антимикробных пептидов человека представлены двумя классами: кателицидином и дефензинами. 

Протеин hCAP18 является единственным кателицидином человека, С-терминальный регион молекулы которого, состоящий из 37-аминокислотных остатков (LL-37), обладает противомикробной и иммунотропной активностью, модулируя экспрессию сотен генов в моноцитах, эпителиальных и других клетках. Пептид может индуцировать (табл. 5) и подавлять провоспалительные эффекты, ингибируя активацию MAPK- и Akt-ассоциированных сигнальных путей. Отщепленный регион LL-37 представляет собой линейный, катионный, амфипатический, α-спиральный пептид. Он связывается с отрицательно заряженными клеточными мембранами бактерий. После проникновения в мембрану LL-37 вызывает порообразование, которое приводит к гибели бактерии [13, 24, 48, 60]. 

Пептид LL-37 нейтрализует патогенассоциированные молекулярные паттерны (например, липотейхоевые кислоты, пептидогликан), тем самым подавляя провоспалительный ответ [9]. Пептид LL-37 и его производные обладают достаточно выраженным терапевтическим потенциалом, как бактерицидным, так и репарационным. Пептид LL-37 индуцирует пролиферацию эпителиальных и стромальных клеток, способствуя заживлению ран [16]. Показано, что некоторые дериваты LL-37 обладают более выраженной антибактериальной активностью, чем непосредственно пептид LL-37 [19]. Так, Elisabeth M. Haisma и соавт. [18], модифицировав пептид –LL-37, получили пептид α-спиральный амфипатический P10 (LAREYKKIVEKLKRWLRQVLRTLR), который обладает более выраженным антимикробным эффектом против грамотрицательных и –грамположительных бактерий и грибов (Candida albicans и Aspergillus niger), чем LL-37. Авторами было продемонстрировано, что P10 может эффективно контролировать инфекции, ассоциированные с атопическим дерматитом. 

Man Hou и соавт. [23] на экспериментальных животных продемонстрировали, что пептид LL-37 способствует саногенезу пневмонии, вызванной метициллинрезистентными бактериями Staphylococcus aureus (methicillin-resistant Staphylococcus aureus — MRSA). В экспериментальной работе Brandon J.H. Banaschewski и соавт. [3] показали возможность использования кателицидиновых пептидов LL-37, CATH-1, CATH-2, CRAMP, обладающих антибактериальной активностью против MRSA и Pseudomonas aeruginosa, при лечении бактериальной пневмонии. Авторы решили вопрос доставки АПМ в респираторный тракт: они разработали интратрахеальный метод введения АМП в сочетании с сурфактантом.

В настоящее время исследуется бактерицидная активность различных дериватов кателицидина и возможность их терапевтического использования (табл. 6) [24, 34, 49, 50].

Согласно результатам исследований Stephanie M. Barksdale [5], самым эффективным бактерицидным действием против MDR Acinetobacter baumanii и Klebsiella pneumoniae и минимальным токсическим влиянием обладает AM-CATH36 дериват кателицидина американского аллигатора.

Дефензиновые пептиды образуют три семейства α-, β- и θ-дефензинов.

Впервые дефензины млекопитающих были описаны в 1956 году Robert C. Skarnes и Dennis W. Watson [53] как лейкины и James G. Hirsch [22] — как фагоцитины полиморфноядерных лейкоцитов кролика. В серии работ H.I. Zeya и John K. Spitznagel [65] показали, что данные протеины относятся к одному молекулярному семейству, которое они определили как семейство катионных антимикробных протеинов, и только в 1985 году Michael E. Selsted и соавт. [51] дали им современное название — дефензины. 

Человеческие дефензины представляют собой семейство амфифильных, катионных, богатых цистеиновыми остатками пептидов с молекулярной массой 3–4 kDa, молекула которых состоит из 29–47 аминокислотных остатков [2]. 

Молекулы дефензинов отличаются высоким содержанием положительно заряженных аргининовых, лизиновых остатков, аминокислот с гидрофобными боковыми группами и обязательным наличием шести цистеиновых остатков, образующих три внутримолекулярных дисульфидных мостика, которые функционально стабилизируют молекулу от деградации протеазами. В настоящее время идентифицировано три типа дефензинов: α-дефензины, b-дефензины и θ-дефензины. У человека обнаружены α-дефензины и b-дефензины. Циклические θ-дефензины обнаружены только у макаки-резус (Macaca mulatta). Из-за короткой аминокислотной последовательности (18 аминокислотных остатков) θ-дефензины получили альтернативное название — мини-дефензины. Показано, что у человека экспрессируются мРНК θ-дефензинов, но так как человеческие гены (DEFT) θ-дефензинов содержат в сигнальном регионе гена стоп-кодон, который прерывает трансляцию, соответствующие пептиды в человеческом организме не синтезируются [1].

Молекулы различных классов дефензинов отличаются длиной аминокислотных последовательностей и аранжировкой дисульфидных связей. Аминокислотная последовательность молекул дефензинов характеризуется двумя формулами, характерными для α- и β-дефензинов. Молекулы α-дефензинов характеризуются последовательностью xxCxCxxxxxCxxxxxxxGxCxxxxxxxxxCCxx, где х представляет разные аминокислотные остатки, а C — цистеиновые остатки, которые в данной аминокислотной последовательности связаны в позициях Cys¹-Cys⁶, Cys²-Cys⁴, Cys³-Cys⁵; молекулы β-дефензинов — CxxxxxxCxxxxCPxxxxxxxxCxxxxx(х)CCxx, у которой цистеиновые остатки связаны в позициях Cys¹-Cys⁵, Cys²-Cys⁴, Cys³-Cys⁶ (рис. 4) [1]. 

Согласно данным рентгеновской кристаллографии, несмотря на разницу в аминокислотной последовательности, вторичная структура различных дефензинов удивительно похожа. Она представляет антипараллельный β-складчатый лист, который стабилизирован тремя внутримолекулярными ди–сульфидными связями (рис. 5) [2].

В 1980 году α-дефензины впервые были выделены в отдельную структурно-функциональную группу, которая в настоящее время представлена нейтрофильными или миелоидными (human neutrophils peptides — HNP) α-дефензинами (HNP-1, HNP-2, HNP-3, HNP-4) и кишечными α-дефензинами клеток Панета (HD5, HD6). Нейтрофильные α-дефензины участвуют в антибактериальной защите, а α-дефензины, секретируемые клетками Панета, преимущественно управляют жизнедеятельностью микрофлоры кишечника [1].

В 1991 году Gill Diamond и соавт. [11] в ткани языка коровы идентифицировали первый представитель β-дефензинов млекопитающих, который получил название трахеального антимикробного пептида TAP (tracheal antimicrobial peptide). В 1995 году Klaus W. Bensch и соавт. [6] из диализата гемофильтрата выделили первый человеческий β-дефензин (HBD-1), молекула которого состояла из 36 аминокислотных остатков. В настоящее время субкласс β-дефензинов объединяет более 40 пептидов, которые являются ключевыми компонентами системы неспецифической противоинфекционной защиты слизистых оболочек респираторного, пищеварительного, урогенитального трактов и кожных покровов. Наиболее изучены 4 представителя β-дефензинов — HBD-1, HBD-2, HBD-3, HBD-4. Пептидные представители субкласса β-дефензинов отличаются по молекулярному строению и уровню положительного заряда. Так, пептид HBD-1 состоит из 36 аминокислотных остатков и характеризуется уровнем заряда +5, HBD-2 состоит из 41 аминокислотного остатка и поддерживает уровень заряда +7, HBD-3 содержит 45 аминокислотных остатков, поддерживает уровень заряда +11. Представляет интерес, что высокие уровни экспрессии мРНК –HBD-3 регистрируются, как правило, в здоровых тканях макроорганизма [1].

Дефензины, как и LL-37, обладают выраженным иммуномодулирующим действием [66].

Новые АМП, полученные из C-терминального региона молекулы человеческого бета-1-дефензина (HBD-1), октапептид (RGKAKCCK) и АТСС –НТВ-37 обладают более выраженной бактерицидной активностью и не токсичны по отношению к Caco-клеточной линии человека 2 даже при высоких концентрациях (до 60 мкг/мл) [54].

Синтетические θ-дефензины представлены ретроциклинами 1, 2 и 3 (табл. 7) [8, 55]. 

Ретроциклины 1 и 2 обладают выраженной активностью против ВИЧ-1 [45]. 

В настоящее время еще не созданы дериваты или аналоги человеческих дефензинов, которые можно было бы использовать в качестве лекарственных средств при лечении инфекционных заболеваний респираторного тракта.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии какого-либо конфликта интересов при подготовке данной статьи.